ZIEHL-NEELSEN-FOLT: INDOKLÁS, REAGENSEK ÉS TECHNIKA - BIOLÓGIA - 2025

A Ziehl-Neelsen színező technika a mikroorganizmusokkal szemben rezisztens alkoholsav (ARA) azonosítására. Ennek a mikrobiológiai eljárásnak a neve a szerzőkre utal: Franz Ziehl bakteriológus és Friedrich Neelsen patológus.

Ez a technika a differenciálfestés egyfajta típusa, amely különféle színezékek használatát vonja maga után annak érdekében, hogy kontrasztot teremtsen a megfigyelni, megkülönböztetni és később azonosítani kívánt szerkezetek között. A Ziehl-Neelsen foltot bizonyos típusú mikroorganizmusok azonosítására használják.

Ziehl-Neelsen folt

Ezek közül a szervezetek közül néhány mycobacteria (pl. Mycobacterium tuberculosis), nocardia (pl. Nocardia sp.), És néhány egysejtű parazita (pl. Cryptosporidium parvum). Számos baktérium osztályozható egy általános módszerrel, az úgynevezett Gram-folttal.

Egyes baktériumcsoportok azonosításához más módszerekre van szükség. Az olyan technikák, mint a Ziehl-Neelsen folt, színezékek kombinációját igénylik, hogy rögzítsék az előzőt a sejtfalhoz.

Ezután egy fehérítő folyamat jön létre, amely két eredményt eredményez: ellenállást vagy érzékenységet a savak és alkoholok elszíneződésének.

bázis

Ennek a festési módszernek az indokolása ezen mikroorganizmusok sejtfalának tulajdonságain alapszik. A fal egy típusú zsírsavból áll, úgynevezett mikolsavakból; Ezeket nagyon hosszú láncok jellemzik.

Ha a zsírsavak nagyon hosszú szerkezetűek, könnyebben visszatartják a színezékeket. Néhány baktérium nemzetet nagyon nehéz megfestni grammfestéssel, mivel a sejtfalban magas a mikolsavak tartalma.

A Ziehl-Neelsen-folt a fenolos vegyület, a carbol fuchsin, az alapfesték felhasználására szolgál. Ez képes kölcsönhatásba lépni a sejtfal zsírsavaival, amelyek textúrája viaszos szobahőmérsékleten.

A Carbol fukszin festése hő jelenlétében fokozódik, mivel a viasz megolvad és a festékmolekulák gyorsabban mozognak a sejtfalba.

A később használt sav kiszínezi a nem festett sejteket, mert faluk nem volt kellő mértékben kapcsolatban a festékkel; ezért a savas fehérítő erőssége képes eltávolítani a savfestéket. Azokat a sejteket, amelyek ellenállnak ennek a elszíneződésnek, sav-gyorsnak nevezik.

Másodlagos színezék

A minta elszíneződése után kontrasztba kerül egy másik festékkel, úgynevezett másodlagos festékkel. Általában metilénkék vagy malachitzöld van.

A másodlagos festék megfesti a háttér-anyagot, és következésképpen kontrasztot teremt azokkal a szerkezetekkel, amelyeket az első lépésben festettek. Csak a elszíneződött sejtek képesek abszorbeálni a második festéket (ellenfestés) és színüket, míg a sav-gyors sejtek megtartják piros színüket.

Ezt az eljárást gyakran használják a Mycobacterium tuberculosis és a Mycobacterium leprae azonosítására, amelyeket sav-gyors bacillusnak hívnak.

reagensek

Elsődleges színezőanyag

0,3% karbol-fuksint (szűrt) használunk. Ezt a festéket alkoholok keverékéből állítják elő: fenol etanolban (90%) vagy metanolban (95%), és ebben a keverékben 3 g bázikus fuksint oldunk.

Fehérítő oldat

Ebben a lépésben 3% alkoholos sav vagy 25% kénsav oldatát használhatjuk.

Másodlagos festék (ellenfesték)

A minták ellentmondására leginkább használt festék általában 0,3% metilénkék. Más anyagok is használhatók, például 0,5% malachitzöld.

Technika

Savas gyors festési eljárás

Készítsen bakteriális kenet

Az előkészítést tiszta, száraz lemezen végzik, a sterilitással kapcsolatos óvintézkedéseket követve.

Kenet szárítás

Hagyja a kenet szobahőmérsékleten megszáradni.

Melegítsük a mintát

A mintát az alsó tárgylemezre tűz alkalmazásával kell melegíteni. Alkoholrögzítést akkor lehet elvégezni, ha a kenet még nem készült köpékkel (nátrium-hipoklorittal kezelték, hogy fehéredjenek), és ha nem fog azonnal elszíneződni.

Az M. tuberculosis eltávolítása fehérítővel és a festési folyamat során történik. A kezeletlen köpet hőmegkötése nem fogja megölni a M. tuberculosis-t, míg az alkohol rögzítése baktériumölő hatású.

Fedjük le a foltot

A foltot a karbol-fukszin oldattal fedjük le (elsődleges bázikus folt).

Melegítse a foltot

Ezt 5 percig végezzük. Figyelembe kell venni a gőz fejlődését (körülbelül 60 ° C). Fontos, hogy ne melegítse túl, és kerülje a minta elégetését.

A folt melegítésekor nagyon óvatosan kell eljárni a carbol fuksin melegítésénél, különösen, ha a festést tálcán vagy más tartályon végezzük, amelyben az előző festés során gyúlékony vegyi anyagok összegyűjtésre kerültek.

Csak csekély lángot szabad a tárgylemezek alá helyezni egy korábban megvilágított tampon segítségével, amelyet néhány csepp savas alkohollal, metanollal vagy 70% etanollal megnedvesített. Kerülje az etanollal átitatott nagy tampon használatát, mivel ez tűzveszélyt jelent.

Mossa le a foltot

Ezt a mosást tiszta vízzel kell elvégezni. Ha a csapvíz nem tiszta, mossa le a kenet szűrt vagy desztillált vízzel, lehetőleg.

Fedjük le a kenet savas alkohollal

Ennek a savas alkoholnak 3% -nak kell lennie. A lefedést 5 percig végezzük, vagy amíg a kenet elég elszíneződött, azaz halványsárga színű.

Figyelembe kell venni, hogy a savas alkohol gyúlékony; ezért óvatosan kell használni. Kerülje a tűzforrások közelében tartózkodást.

Mossa le a foltot

A mosást tiszta, desztillált vízzel kell végezni.

Fedje le a kenet folttal

Lehet malachitzöld (0,5%) vagy metilénkék (0,3%) folttól 1-2 percig, hosszabb időtartamú felhasználással, ha a kenet vékony.

Mossa le a foltot

Ismét tiszta (desztillált) vizet kell használni.

Lefolyni

A tárgylemez hátulját meg kell tisztítani, és a foltot egy lefolyóállványra kell helyezni, hogy megszáradhasson (ne használjon nedvszívó papírt a szárításhoz).

Vizsgálja meg a kenet mikroszkóp alatt

A 100X objektív és az merülő olajat kell használni. Szisztematikusan szkennelje be a kenet és rögzítse a vonatkozó megfigyeléseket.

Értelmezze az eredményeket

Elméletileg a vöröses színű mikroorganizmusokat savgyorsan pozitívnak tekintik (AAR +).

Éppen ellenkezőleg, ha a mikroorganizmusok kék vagy zöld színűek, az ellenfestékként alkalmazott festéktől függően, akkor azok sav-gyorsan negatívnak (AAR-) tekinthetők.

Irodalom

1. Apurba, S. és Sandhya, B. (2016). A gyakorlati mikrobiológia alapjai (1. kiadás). A Jaypee Brothers Medical kiadók.
2. Bauman, R. (2014). Mikrobiológia betegségekkel a testrendszerben (4. kiadás). Pearson Education, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. és Killington, A. (1996). Bevezető mikrobiológia (1. kiadás). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. és Morton, V. (2006). Laboratóriumi kézikönyv és munkafüzet a mikrobiológiában: alkalmazások a beteggondozásban (11. kiadás). McGraw-Hill oktatás.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Mikrobiológiai tankönyv (1. kiadás). BI kiadványok PVT.