BAKTERIÁLIS KENET: JELLEMZŐK ÉS ELŐKÉSZÍTÉS - BIOLÓGIA - 2024

A bakteriális kenet egy vékony filmréteg a baktérium-mikroorganizmusok szuszpenziójáról, amelyet átlátszó üveglapra vagy tárgylemezre készítenek fénymikroszkóp alatt történő megfigyelés céljából.

A film formájában történő meghosszabbítást annak érdekében hajtják végre, hogy a mikroorganizmusokat a lehető legnagyobb mértékben elválaszthassák, mivel ha csoportosulnak, a megfigyelés nem világos.

1. ábra. Pásztázó elektronmikroszkóp alatt látható baktériumkenet. Forrás: pixbay.com

A baktériumtenyészetek tanulmányozásakor kenet-előkészítési, rögzítési és festési technikákat alkalmaznak ezek jobb elemzésére. A mikroorganizmusok kis mérete miatt megfigyelésükhöz szükségszerűen optikai mikroszkópot kell használni.

Az optikai mikroszkópok nélkülözhetetlen eszközök a kenet megfigyeléséhez. Ezek optikai lencséket és fényt használnak, amelyek lehetővé teszik a minták nagyításával történő megtekintését.

Az élő sejtek általában nem rendelkeznek nagyrészt színes szerkezettel, a fénymikroszkóppal látva színtelen, átlátszó minták, és nagyon kevés belső kontrasztot mutatnak és környezetükhöz viszonyítva.

A megfigyelés az egyszerű fényerejű optikai mikroszkóppal, kiegészítő festési technikák nélkül, nagyon korlátozott, és csak bizonyos esetekben alkalmazható, például a mikroorganizmusok mozgásának megfigyelésére.

A mikroorganizmusok optimális megfigyelése érdekében egyensúlyt kell találni a kontraszt és a felbontás között. A sejtek részletei nem láthatók mikroszkóp alatt, még nagy felbontás mellett sem; A színezékek alkalmazására szükség van olyan festési technikák révén, amelyek kontrasztot adnak a megfigyeléshez.

Jó minőségű baktériumkenet jellemzői

Kiváló kontraszt

A kiváló kontraszt elérése érdekében vannak kifinomult mikroszkópok, fáziskontraszt mikroszkópok, differenciál interferencia mikroszkópok és sötét terepi mikroszkópok. Az ilyen típusú mikroszkópot többek között a baktériumszerkezetek, például hüvelyek és szálak megfigyelésére használják.

A festés egy egyszerű módszer a kontraszt növelésére, amelyet fényerő mikroszkóppal érnek el. Ebben a technikában különböző foltok alkalmazhatók, amelyek jelentősen javítják a mikroszkópos megfigyelést.

A foltokat közvetlenül a lemezeken lévő mikroorganizmus-szuszpenziók kenetén vagy kiterjesztésén végezzük, előzőleg megszárítottuk és rögzítettük.

Jó javítás

A fixálás a sejtszerkezetek megőrzésére szolgáló technika; A mikroorganizmusok inaktiválódását és a tapadókorong tapadását okozza. Különböző rögzítő kezelések léteznek: hőrögzítés és kémiai rögzítés.

Hő rögzítés

Ez a legszélesebb körben alkalmazott módszer a baktériumkenet megfigyelésére. A módszer abból áll, hogy a kenet bakteriális szuszpenzióját átgyújtják egy öngyújtó lángján. Ez a technika képes megőrizni a baktériumok külső morfológiáját, de megsemmisíti azok belső szerkezetét.

Kémiai rögzítés

A kémiai rögzítés során tartósítószereket, például formaldehidet vagy formalint, etanolt és ecetsavat használnak. A kémiai rögzítőszerek alkalmazásának előnye, hogy a mikroorganizmusok belső sejtszerkezete megőrződik.

2. ábra. Vérkenet. Forrás: Bobjgalindo, a Wikimedia Commonsból

Jó festés

A korábban megszárított és rögzített kenet festésére a leggyakoribb eljárások a pozitív vagy az egyszerű festés, a differenciálfestés és a negatív festés. Vannak speciális technikák bizonyos sejtszerkezetek (kapszula, spóra, flagella) festésére is.

Pozitív vagy egyszerű festés

A kenetfestési technika a legszélesebb körben alkalmazott pozitív vagy egyszerű festés. Olyan színezékeket használ, amelyek képesek bizonyos mikrobiális struktúrákhoz kötődni, lehetővé téve mikroszkóp alatt történő megfigyelést.

Ezeknek a színezékeknek kémiai szerkezetükben kromofor csoportok (színes rész) vannak, váltakozó kettős kötésekkel és egyszeres kötésekkel (konjugáció). Ezek a kötések viszont ionos vagy kovalens kötéseket hozhatnak létre egyes celluláris struktúrákkal.

A pozitív vagy az egyszerű festéshez használt festékek többnyire anilin kémiai származékai (színes szerves sók).

Másrészt a színezékek közül néhányat találunk bázikus pH-val, mások savas pH-val.

Alapvető színezékek

Az alapfestékekben a kromofórcsoport pozitív elektromos töltéssel rendelkezik. A prokarióta mikroorganizmusok túlnyomó része semleges belső pH-val rendelkezik, sejtfelületük negatív töltésű. Ezen elektrosztatikus kölcsönhatás révén a kromofor kötődik a cellához és megfesti azt.

Az alapfestékekre példa a metilénkék, a kristályibolya, a malachitzöld, a bázikus fuscin, a szafranin.

Savas festékek

Savas színezékeknél a kromofórcsoport negatív elektromos töltéssel rendelkezik. Ezeket használják pozitív töltésű aminocsoportokkal rendelkező fehérjék megfestésére. Savas színezékek például a sav-fuscin, a bengáli rózsa, a Kongói vörös és az eozin.

Differenciálfestés

A differenciálfestési eljárás két különböző színű vagy intenzitású festék alkalmazásával áll, hogy mikroszkóp alatt megkülönböztessék a különböző mikroorganizmusokat. A bakteriológiában a Gram és a sav-alkohol rezisztencia foltok a leggyakrabban használt különbségi foltok.

A Gram-foltot előzetes tesztként használják, hogy megismerjék a sejt alakját, méretét, csoportosulását, valamint a sejtfalat. A Gram folt teszt alkalmazásával a sejtfal baktériumokat gramm pozitív baktériumokba és gramnegatív baktériumokba soroljuk.

Negatív festés

Ebben a technikában olyan kémiai színezékeket használnak, amelyek nem hatolnak át a sejt belsejébe, hanem fekete hátterűvé teszik azt a közeget, amelyben a mikroorganizmusok megjelennek.

A negatív festési eljárás során a kenet csepp indiai tintával vagy nigrosin szuszpenzióval készül, amely szobahőmérsékleten történő szárítás után átlátszó filmréteg képződik a fény átjutására. Ily módon a mikroorganizmusok világos formákként jelennek meg a sötét háttér előtt.

Készítmény

A. Kenet

1.- Mossa ki a lemezeket nagyon jól, szárítsa meg abszorbens papírral, és címkézze le őket. A címkén fel kell tüntetni a készítmény tartalmát, a dátumot és a feldolgozó személy nevét.

2.- Hagyja meg az öngyújtót, és sterilizálja a beoltási hurkot a lángban, amíg fényesen vörös nem lesz.

3.- Hagyja lehűlni a fogantyút.

4.- Vegye ki a baktériumtenyésztő csövet, vegye le a kupakot, és gyorsan vezesse át a cső száját az égő lángja (láng) közelében.

5. - Helyezze a beoltási hurkot a baktériumtenyészetet tartalmazó csőbe, és vegye a mintát.

6.- Ha a tenyészet folyékony közegben van, akkor a fogantyúval vett mintát helyezze a tárgylemez közepére, és óvatosan szétoszlatja kb.

7.- Sterilizálja ismét a beoltási hurkot.

8.- Hagyja, hogy a kenet megszáradjon a levegőben.

9.- Ismételje meg a 3–8 lépést háromszor.

10.- Ha a tenyészet szilárd tápközegben van, akkor egy csepp desztillált vizet kell előzőleg a lemezen helyezni. Ezt úgy végezzük, hogy a tenyészetből egy kis mintát összekeverünk a beoltási hurokkal, a 2–5. Lépés szerint (aszeptikus körülmények között).

11. - A hígított mintát csepp vízcseppekkel terjessze a tárgylemezre, és ismételje meg háromszor.

B. Rögzítés

1.- Adjunk hozzá két csepp metanolt vagy abszolút etanolt a száraz kenethez - folyékony közegben lévő tenyészetekből.

2.- Hagyja szárítani a levegőt az öngyújtótól.

3.- Ha a kenet szilárd táptalajból származó tenyészetből származik, akkor a száraz kenetet melegítéssel rögzítik, gyorsan 2-3 alkalommal haladva át a könnyebb láng legforróbb részén.

4.- Érintse meg a kenet alsó részét a bal kéz hátulsó részével (jobbkezesekhez; egyébként használja a jobbkezeset) és ellenőrizze, hogy hideg-e.

C. Egyszerű festés

1.- Adjon hozzá 2 csepp a kiválasztott foltot a kenethez, és hagyja, hogy az egyes foltokra vonatkozó speciális protokollokban előírt ideig maradjon (általában 1 és 5 perc között).

2.- Egyes foltok aktiválásához hőt kell igényelni, ebben az esetben nagyon óvatosnak kell lennie, amikor a tárgylemezt melegíti a könnyebb lángban (csipesszel kezelje és ne forraljon). A kenet túlhevítése megsemmisítheti a megfigyelt sejteket.

3.- Távolítsa el a felesleges színezőanyagot desztillált vízzel történő mosással a picettől. Távolítsa el a mosóvizet úgy, hogy óvatosan megcsapja a csúszkát a szélére, és megdönti a munkaasztalra.

4.- Hagyja megszáradni a levegőt.

5.- A megfigyelés típusától függően ebben a szakaszban fedőlapot használnak vagy sem. A takarólemez védi és megőrzi a kenet. Ha ebben a szakaszban olajimmerziós megfigyelést végeznek, nem használnak fedőcsíkot, de a kenet nem tartható meg.

D. A kenet végleges megőrzése

1.- Merítse a kenet egymás után az alábbiakban felsorolt ​​oldatokba, legalább 5 percig. Ezen "fürdő" célja a kenet teljes kiszáradása. Minden egyes reagenst alaposan le kell üríteni, mielőtt a kenet a következő fürdőbe kerülne.

A dehidratáló fürdők sorrendje a következő:

1. 70% etanol
2. 95% etanol
3. Tiszta aceton
4. Aceton-xilol 1: 1 arányú keveréke
5. xilol

Ezután hagyja megszáradni.

2.- Helyezze fel a fedőlemezt, lehetőleg 22 × 22 mm-re, kanadai balzsam vagy más rögzítő közeg segítségével.

Irodalom

1. Briggs, G. (1965). A mikrobiológiai laboratóriumi balesetek és fertőzések okozati tényezői. USA hadsereg biológiai laboratóriumai. Fort Detrick.
2. Cappucino, JG és Welch, CT (2017). Mikrobiológia: laboratóriumi kézikönyv. Pearson.
3. Holt, JG szerkesztő. (1977). A rövidebb Bergey-kézikönyv a determináns bakteriológiáról. 8 ^th Baltimore: The Williams and Wilkins Co.
4. Johnson, TR és Case; CL (2018). Mikrobiológiai laboratóriumi kísérletek. Pearson.
5. Tille, P. (2017). Diagnosztikai mikrobiológia. 14 ^-én St. Louis, Amerikai Egyesült Államok: Elsiever, Inc.