LÖWENSTEIN-JENSEN KÖZEG: ALAPOZÁS, ELŐKÉSZÍTÉS ÉS FELHASZNÁLÁS - BIOLÓGIA - 2025

A Löwenstein-Jensen táptalaj szelektív szilárd táptalaj a Mycobacterium nemzetségbe tartozó baktériumok - például a Mycobacterium tuberculosis, a M. avium - izolálására és fejlődésére, többek között, a leprae fajok kivételével, amely nem tenyészthető.

A Mycobacterium nemzetség baktériumai nem szaporodnak a hagyományos tenyésztő tápközegekben, ezért elkülönítésükhöz speciális tápközeget kellett kialakítani. Az eredeti médiumot Löwenstein készítette, majd Jensen módosította.

Löwenstein-Jensen táptalaj Mycobacterium tuberculosis telepeivel. Forrás: Agarwal és mtsai / BioMed Central Ltd., a Biology Image Library hozzájárulásával

A módosítás a kongói vörösfesték eltávolításából állt, és magasabb koncentrációjú malachitzöldre váltotta fel. Ez megváltoztatta a magnézium-citrát és a monokálium-foszfát koncentrációját is.

A Löwenstein-Jensen táptalaj jelenleg burgonyakeményítőt, aszparaginot, magnézium-citrátot, monokálium-foszfátot, magnézium-szulfátot, malachitzöld, nalidixinsavat, cikloheximidot, linkomicint, megvert tojásokat, glicerint és vizet tartalmaz.

A mikobaktériumokat általában olyan helyektől, amelyek nem sterilek, például köpet, vizelet, tályogok izolálják. Ez azt jelenti, hogy a minták többsége a terület szokásos mikrobiotáját, valamint a kórokozót tartalmazza.

Éppen ezért a Löwenstein-Jensen táptalaj inhibitorok sorozatát tartalmazza összetételében, amelyet malachitzöld, antibiotikumok és gombaellenes szerek képviselnek.

Ezenkívül a nem steril helyektől származó mintákat fertőtleníteni és semlegesíteni kell, mielőtt a Löwenstein-Jensen táptalajba beoltják.

bázis

A tojás és a glicerin jelenléte a Löwenstein-Jensen táptalajban serkenti a mikobaktériumok szaporodását, mivel ezek biztosítják az ezen mikroorganizmusok fejlődéséhez szükséges zsírsavakat és fehérjéket.

A Löwenstein-Jensen táptalaj malachitzöldet tartalmaz, amely gátolja a kísérő mikrobiótát. De tartalmaz nalidixinsavat (35 μg / ml), amely gátolja a gram-negatív mikrobiótát, cikloheximidet (400 μg / ml), amely gátolja a szaprofit gombákat és élesztőket, valamint lincomicint (2 μg / ml), amely gátolja a grampozitív mikrobiótát.

Néhány kereskedelmi ház inkább az alábbi antibiotikumok kombinációját kívánja hozzáadni: polimixin B 200 000 egység / L, amfotericin B 10 mg / L, karbenicillin 50 mg / L és trimetoprim 10 mg / L.

Ez a táptalaj nem tartalmaz agart, ezért a tápközeg megszilárdulása a tojásban lévő albumin koagulációja miatt történik a sterilizálás során.

Készítmény

Mérjünk be 37,3 g dehidrált tápközeget 600 ml desztillált vízben, amelyhez korábban 12 ml glicerint adtunk. Az elegyet melegítjük, gyakran keverjük, amíg teljesen fel nem oldódik. Autoklávozzuk a közeget 121 ° C-on 15 percig.

Másrészt aszeptikus körülmények között el kell készíteni az 1000 ml friss tojás homogén szuszpenzióját. Adjuk hozzá a tojás szuszpenziót az elkészített 600 ml tápközeghez, 50–60 ° C hőmérsékleten, elkerülve a légbuborékokat.

Az autoklávban történő sterilizálás után antibiotikum oldatokat is hozzáadunk.

Öntsük a tápközeget steril, csavarral lezárt tesztcsövekbe. Melegítsük a csöveket 85 ° C-on 45 percig ferde helyzetben.

Az elkészített táptalaj akvamarinzöld színű, fehéres foltokat jeleníthet meg a tojás lipidek jelenléte miatt.

A tápközeg pH-jának 7,2 ± 0,2-nek kell lennie

A csöveket hűtőszekrényben tárolandó, felhasználásig közvetlen fénytől védve. Temper vetés előtt.

Van egy közeg módosítása, amelyet "Löwenstein Jensen Gruft módosítása" -nak hívnak. Ez ugyanazokat a vegyületeket tartalmazza, mint a klasszikus táptalaj, de hozzáadunk 5 mg / 100 ml RNS-t, és inhibitorként 0,025 g / 100 ml malachitzöld, 50 U / ml penicillin és 35 ug / ml nalidixinsav tartalmát tartalmazza.

Alkalmazások

A Löwenstein-Jensen tápközeget különféle mintákból származó mycobacteriumok izolálására használják. Ziehl-Neelsen-folt ajánlott minden olyan mintához, amelynél gyanítható a mikobaktériumok jelenléte.

Egyes minták steril helyekről származnak, mások nem. A nem steril mintákat megfelelő módon kell fertőtleníteni:

Köpet

A köpékmintákat a következők szerint kell fertőtleníteni: meghatározzuk a köpetmintának mennyiségét ml-ben, és adjunk ugyanolyan mennyiségű 4% NaOH-t a mintához, és inkubáljuk 37 ° C-on.

Rázza meg a keveréket gyakran 30 percen belül. Ezt követően centrifugáltuk 3000 fordulat / perc sebességgel 30 percig.

A felülúszót egy fenolos fertőtlenítő oldat felett dobjuk el. Az üledéket vetésre használja, de először a pH-t semlegesíteni kell.

Ahhoz, hogy semlegesítse az üledék, 5% H ₂ SO ₄ használunk jelenlétében a fenolvörös indikátort, amíg el nem éri a semleges pH okozza a lazac színű.

Gyomormosás, hörgőmosás és hörgőszívás

Ebben az esetben a mintát 3000 percenkénti fordulatszámmal 30 percig centrifugálni kell. A felülúszót megsemmisítjük, és a pelletet használjuk. Az üledék szennyeződésmentesítéséhez adjunk hozzá 3 ml 4% -os nátrium-hidroxid-oldatot, és fél órán keresztül rendszeresen keverjük 37 ° C-on.

Ismét centrifugáljuk, a felülúszót eldobjuk, és a pelletet használjuk. Ez utóbbit semlegesíteni kell, ahogyan azt a köpetmintában kifejtik.

Vizelet

Hagyja a mintát hűtőszekrényben 24 órán át ülepedni. Válassza le a felülúszót. A fennmaradó üledéket 30 percig centrifugálni kell 3000 fordulatszámon. A felülúszót ismét dobjuk el, és a pelletből 3 ml steril fiziológiás oldatot készítünk.

Adjunk hozzá 3 ml 4% nátrium-hidroxid-oldatot, majd végezzük a szennyeződésmentesítést és a semlegesítést az előzőekben leírtak szerint.

Ascites folyadék, pleurális folyadék, cerebrospinális folyadék

Az ilyen típusú mintában centrifugálják, és a felülúszót eldobják. Végezzen egy grammot az üledékre, vagy figyelje meg közvetlenül a mikroszkóp alatt; Ha nem észlelnek baktériumokat, akkor sem a szennyeződésmentesítés, sem a semlegesítés nem szükséges.

Ebben az esetben a mintát közvetlenül az üledék segítségével be lehet vetni. Ha baktériumok vannak, akkor a fent leírtak szerint fertőtleníteni és semlegesíteni kell.

biopszia

Az ilyen típusú mintához 5 ml desztillált vizet kell hozzáadni a későbbi centrifugáláshoz 1500 fordulat / perc sebességgel 10 percig. Dobjuk el a felülúszót és centrifugáljuk a pelletet 3500 fordulat / perc sebességgel 30 percig. Az üledéket a tápközeg bevetésére használjuk.

Laringális tampon

A tampont egy steril csőbe kell helyezni, amely egyenlő részben desztillált vizet és 4% NaOH-t tartalmaz. A tampont meg kell nyomni a cső falához úgy, hogy a minta híguljon a folyadékban. Centrifugáljuk és használjuk az üledéket. Semlegesítse az üledéket a fent leírtak szerint.

elvetett

A Löwenstein-Jensen tápközeget oltjuk oly módon, hogy a táptalaj felületére 0,5 ml mintát adunk. Forgassa el a csövet a minta eloszlatására a táptalajban. Ne használjon platina fogantyút.

Egy második, Stonebrink tápközeget tartalmazó csőbe be lehet vetni a Mycobacterium bovis és más olyan fajok izolálására, amelyek nem nőnek a Löwenstein-Jensen táptalajon.

Inkubációs

A beoltott csöveket aerob módon inkubáljuk 37 ° C-on, a fedél enyhén laza, körülbelül 5 ° -ra dőlve és fénytől védve. A környezetet 5–10% szén-dioxiddal dúsíthatjuk. Hetente kétszer ellenőrizze a tenyészeteket, amíg a telepek meg nem jelennek.

Amikor a minta felszívódik, a kupakokat meghúzzák. A maximális inkubációs idő 8 hét, ha ezen idő után nincs növekedés, akkor negatívnak számolják.

QA

A következő törzsek használhatók minőség-ellenőrzésként:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus Pyccoccus 1964, 1964

Az első három említett faj kiváló fejlődése várható, a M. fortuitum növekedésének jónak kell lennie, míg az M. bovis esetében kevés vagy egyáltalán nem várható növekedés. Eközben a Mycobacterium nemzetségtől eltérő fajokat teljes mértékben gátolni kell.

korlátozások

Az elkészített tápközeget védeni kell a fénytől, hosszabb ideig tartó fényhatás miatt a táptalaj zöldről kékre változik, ebben az esetben a táptalaj már nem használható. Ennek oka az, hogy a malachitzöld fényérzékeny.

A tápközeg, mivel tojásokat tartalmaz, könnyen szennyeződhet, ha nem aszeptikusan kezelik. Feloldható, ha szennyeződik proteolitikus baktériumokkal.

A Mycobacterium nemzetségbe tartozó baktériumok tenyésztéséhez és kezeléséhez képzett személyzet szükséges, akik tisztában vannak a biológiai biztonsági intézkedésekkel, amelyeket be kell tartani, hogy elkerüljék a szennyeződést vagy a többi ember szennyeződését.

A sósav nem használható a semlegesítési lépésben, mert nátrium-klorid képződik, amely mérgező lehet Koch bacillusára.

A mintákat hűtve kell tartani és fénytől védeni, miközben nem dolgozzák fel.

Referencia

1. Francisco Soria Melguizo Laboratories. 2009. Löwenstein-Jensen szelektív közeg. Elérhető a következő címen: f-soria.es
2. Britannia Laboratories. 2017. Löwenstein-Jensen közeg. Elérhető a következő címen: britanialab.com.
3. Neogen Laboratories. Löwenstein-Jensen közeg. Elérhető a következő címen: foodsafety.neogen.com.
4. "Löwenstein-Jensen közeg." Wikipédia, a szabad enciklopédia. 2018. november 20., 15:15 UTC. 2019. április 24., 18:34. wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiológiai diagnózis. 5. kiadás Szerkesztő Panamericana SA Argentina.
6. Forbes B., Sahm D., Weissfeld A. (2009). Bailey és Scott mikrobiológiai diagnózisa. 12 ed. Szerkesztő Panamericana SA Argentina.
7. Mac Faddin J. (2003). Biokémiai vizsgálatok a klinikai jelentőségű baktériumok azonosítására. 3. szerk. Szerkesztő Panamericana. Buenos Aires. Argentína.