SPÓRAFESTÉS: INDOKLÁS, TECHNIKÁK ÉS FELHASZNÁLÁSOK - BIOLÓGIA - 2026

A spórafestés az a rezisztenciaszerkezet színezésére alkalmazott módszer, amely kedvezőtlen körülmények között baktérium nemzetségeket alkot; Ezek a struktúrák megfelelnek a túlélés egy formájának.

Sok nemzetség alkot spórákat; a legfontosabbak azonban a Bacillus és a Clostridium. Ezeket a nemzetségeket relevánsabbnak tekintik, mivel az emberek számára patogén fajok vannak.

Spórafestés a Shaeffer - Fulton vagy Wirtz-Conklin módszerrel. És tambe (eredeti feltöltő), a Wikimedia Commonsból

Minden bacillus spórát okozhat. A készítmény festésekor a spóra a bacillusban (endospore) vagy azon kívül (exospore) található. A baktériumokkal szemben alkalmazott hagyományos festési technikákkal - például a Gram-folttal - a spórák színtelenek maradnak.

Jelenleg számos olyan festési módszer létezik, amely képes a spóra vastag szerkezetébe áthatolni, hogy azt megfestse. Ezek a módszerek nagyon változatosak; Ide tartoznak a Dorner technika, a Möeller folt és a Shaeffer - Fulton módszer, más néven Wirtz-Conklin.

Az említett technikák közül a Shaeffer-Fulton módszert alkalmazzák a legszélesebb körben alkalmazott rutin laboratóriumokban. Két mikrobiológusnak nevezték el, akik 1930-ban létrehozták a színezést: Alicia Shaeffer és MacDonald Fulton. A technikát azonban néha Wirtz-Conklin-nek nevezik az 1900-as évek két bakteriológusa után.

bázis

A spórák nem foltok a hagyományos foltokkal, mert nagyon vastag falúak. A spórák komplex összetétele megakadályozza a legtöbb színezék bejutását.

Ha a spórát kívülről vizsgálják, akkor a következő rétegeket figyelik meg: először az exosporium van, amely a legvékonyabb és a külső réteg, amelyet a glikoproteinek képeznek.

Ezután következik a kutikula, amely ellenáll a magas hőmérsékletig, majd a peptidoglikánból álló kéreg. Később az alap falát védi a protoplaszt.

A spóra dehidrált struktúra, amely 15% kalciumot és dipikolinsavat tartalmaz. Ezért a legtöbb spórafestési technika a hő alkalmazásán alapszik, hogy a festék behatoljon a vastag szerkezetbe.

Miután a spóra megfestette, nem tudja eltávolítani a festéket. A Shaeffer - Fulton technikában a malachitzöld belép a vegetatív sejtekbe, és hő alkalmazásakor behatol az endoszpórába és az exospókákba.

Vízzel történő mosással a festéket eltávolítják a vegetatív sejtből. Ennek oka az, hogy a malachitzöld festék enyhén bázikus, tehát gyengén kötődik a vegetatív sejthez.

Ehelyett nem tud kijutni a spórából, és végül a bacillust ellenszennyeződött szafraninnal. Ez az alap az érvényes a többi technika számára, amelyben valami hasonló történik.

Spórafestési technikák

A spórafestés elvégzéséhez tiszta tenyészetet kell beszerezni a vizsgálni kívánt gyanús törzsből.

A tenyészetet 24 órán át extrém hőmérsékleten tartjuk, hogy stimuláljuk a mikroorganizmus sporulációját. Ehhez a tenyészetet 44 vagy 48 ° C-os sütőbe vagy hűtőszekrénybe (8 ° C) tehetjük 24 vagy 48 órán keresztül.

Ha túl sokáig hagyják az említett hőmérsékleteken, akkor csak exospórákat figyelnek meg, mivel az összes endospóra már kilépett a bacillusból.

Az idő végén néhány csepp steril élettani oldatot kell a tiszta lemezen helyezni. Ezután a tenyészet egy kis részét elveszik, és finoman eloszlatják.

Ezután hagyjuk megszáradni, rögzítjük a melegben és az alábbiakban ismertetett eljárások egyikével festettem:

Dorner technika

1- Készítsen egy kémcsőbe a sporálódott mikroorganizmus koncentrált szuszpenzióját desztillált vízben, és adjon hozzá azonos mennyiségű szűrt Kinyoun-karbol-fuksint.

2- Helyezze a csövet forrásban lévő vízfürdőbe 5-10 percig.

3 - Egy tiszta lemezen keverje össze az előző szuszpenzió egy cseppjét 10% -os vizes nigrozin oldattal, felforralja és szűrje.

4- Gyengéden hővel gyorsan eloszlatva és szárítva.

5- Vizsgálja meg 100X objektívvel (merítés).

A spórák vörös színűek és a baktériumsejtek sötét szürke háttér mellett szinte színtelennek tűnnek.

Módosított Dorner technika

1- A sporált mikroorganizmus szuszpenzióját eloszlatják egy tárgylemezen és rögzítik a melegben.

2- A mintát egy szűrőpapír szalaggal borítják, amelyhez karbolfuksint adnak. A színezéket 5-7 percig melegítjük a Bunsen égő lángján, amíg a gőzök fejlődnek. Ezután a papírt eltávolítják.

3 - A készítményt vízzel mossuk, majd abszorbens papírral szárítjuk.

4- Fedje le a kenet egy vékony, 10% -os nigrosin filmmel, egy második lemezt használva a nigrosin vagy egy tű eloszlatására.

A spórák és baktériumok által elszíneződött szín ugyanaz, mint a technika állása szerint.

Shaeffer - Fulton vagy Wirtz-Conklin technika

1- Készítsen finom kenetet a sporulált mikroorganizmus szuszpenziójával a lemezen, és rögzítse a melegítéshez.

2- Fedje le a lemezt 5% malachitzöld vizes oldattal (szűrőpapírt helyezhet a lemezen).

3- Melegítse a Bunsen égő lángján, hogy gőzök szabaduljanak fel, és távolítsa el a lángot. Ismételje meg a műveletet 6-10 percig. Ha a malachitzöld oldat túl sokat elpárolog az eljárás során, még többet adhatunk hozzá.

4- Távolítsa el a szűrőpapírt (ha van) és mossa le vízzel.

5- Fedje le a lemezt 0,5% -os vizes szafraninnal 30 másodpercig (a technika egyes változatai 0,1% vizes szafranint használnak, és hagyják 3 percig).

Ezzel a módszerrel a spórák zöldnek és a bacillus vörösnek tűnnek.

Ennek hátránya, hogy a fiatal kultúrák endospórai nem festenek jól, mivel rendkívül tiszta vagy színtelenek. Ennek elkerülése érdekében ajánlatos 48 órás inkubációs tenyészeteket alkalmazni.

Möeller technika

1- Fedjük le a kenet kloroformmal 2 percig.

2- Dobja el a kloroformot.

3- Fedjük le 5% krómsavval 5 percig.

4- Mossa le desztillált vízzel

5- A lapot fabszin-fenikád karbollal borítják, és a gőzök kibocsátásáig a Bunsen égő lángjának vannak kitéve. aztán néhány percre eltávolítják a lángból. A műveletet addig ismételjük, amíg a 10 percet nem fejezi be.

6- Mossuk le vízzel.

7- Színezzen savanyított etanolt (sósav-alkoholt). Hagyja 20 vagy 30 másodpercig.

8- Mossuk desztillált vízzel.

9 - Kontrasztálja úgy, hogy a lemezt metilénkékkel borítja 5 percig.

10- Mossuk desztillált vízzel.

11. Hagyja megszáradni, és a mintát vigyék a mikroszkópba.

A spórák vörös színűek és a bacillák kék színűek. Fontos, hogy ne lélegezzen be a gőzökbe, mivel mérgezőek és hosszú távon rákkeltőek.

Módosított Möeller technika hő nélkül

2007-ben Hayama és munkatársai a Möeller technika módosítását készítették. Kiküszöbölték a festék melegítésének lépését és helyettesítették 2 csepp Tergitol 7 felületaktív anyag hozzáadásával minden 10 ml karbol-fuksin-karbol-oldathoz. Ugyanezeket az eredményeket kapták.

Alkalmazások

A spórák elszíneződése nagyon értékes és hasznos információt nyújt a kórokozó azonosításához, mivel annak jelenléte, alakja, a bacilluson belüli elhelyezkedése és a vegetatív sejt deformálódásának képessége olyan adatok, amelyek a faj irányításához részt vesz egy bizonyos műfajban.

Ebben az összefüggésben érdemes azt mondani, hogy a spórák lehetnek kerek vagy oválisak, elhelyezkedhetnek középen, vagy paracentralis, subminális vagy terminális helyzetben is.

Az endoszpórák és az exoszpórák alakjának és helyzetének vázlata

Példák

- A Clostridium difficile végső helyzetben ovális spórát képez, amely deformálja a bacillust.

- A Clostridium tertium spóra ovális, nem deformálja a bacillust, és a terminál szintjén helyezkedik el.

- A Clostridium tetani endoszpóra végleges és deformálja a bacillust, és így dobképződik.

- A Clostridium botulinum, a C. histolyticum, a C. novy és a C. septicum spórái kerek vagy alatti oválisak és deformálják a bacillust.

- A Clostridium sordelli endoszpóra középső helyzetben van, enyhe deformációval.

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiológiai diagnózis. (5. kiadás). Argentína, szerkesztõ Panamericana SA

Irodalom

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Javaslat egyszerűsített módszerre a baktérium spórák hőkezelés nélküli festésére - a Moeller módszer sikeres módosítása. Eur J Med Res., 2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Wikipedia közreműködői. Moeller folt. Wikipédia, a szabad enciklopédia. 2018. november 3, 03:28 UTC. Elérhető: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M., Rodríguez (2011). Mikrobiológiai technikák laboratóriumi kézikönyve. Alaptudományi Tanszék Mikrobiológiai Akadémia. Nemzeti Politechnikai Intézet.
4. „Endospórafestéket.” Wikipédia, a szabad enciklopédia. 2018. február 25., 10:20 UTC. 2019. január 10., 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J és munkatársak. (2006). Az Extremadura autonóm közösség munkatársai. Különleges napirend IV. Kötet. Szerkesztõ MAD. Sevilla-Spanyolország, 211–212.
6. Silva M., García M., Corrales J, Ponce E. (2006), laboratóriumi technikus szakember, Galíciai Egészségügyi Szolgálat (SERGAS). A konkrét téma napirendje 2. Szerkesztői MAD. Sevilla-Spanyolország, 79–80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiológiai diagnózis. (5. kiadás). Argentína, szerkesztõ Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott mikrobiológiai diagnosztika. 12 ed. Argentína. Szerkesztő Panamericana SA