GRAM FOLT: INDOKLÁS, ANYAGOK, TECHNIKA ÉS FELHASZNÁLÁS - BIOLÓGIA - 2024

A Gram festés a diagnosztikai mikrobiológiában a legegyszerűbb és leghasznosabb festési technika. Ezt a technikát Hans Christian Gram dán orvos 1884-ben hozta létre, aki sikerült osztályoznia a baktériumokat gramm pozitív és gramnegatív anyagként a sejtfal összetétele szerint.

A technikát Hucker 1921-ben bizonyos módosításokon átalakította a reagensek stabilizálása és a festés minőségének javítása érdekében, ezért a Gram-festék Gram-Hucker néven is ismert.

Különböző kenet festett Gram-folttal. A. Gram-pozitív cocci. B. Gram-negatív rudak. C. Gram-pozitív, polimorfonukleáris és mononukleáris baktériumok. D. Élesztők.

Ezzel a módszerrel megfigyelhető a mikroorganizmusok alakja is, azaz ha ezek többek között cocci, bacilli, coccobacilli, pleomorf, rostos. Amellett, hogy megoszlik a térben: klaszterben, láncban, izoláltan, párban, tetradsorban stb.

Bakteriális fertőzés gyanúja esetén a kapott minták nagy részét egy tárgylemezen kell bekenni, és a mikroszkópos vizsgálathoz Gram-anyagot kell festeni.

A Gram-jelentés útmutatást ad az orvosnak arról, hogy milyen típusú mikroorganizmusok okozhatják a fertőzést, mielőtt megkapják a végső tenyésztési eredményt.

Egyes esetekben a beteg élete nagyon veszélyeztetett, ezért az orvosoknak sürgősen szükségük van a Gram-jelentésre egy empirikus kezelés meghozatala céljából, miközben várják a mikroorganizmus azonosítását.

Például, ha a Gram azt tapasztalja, hogy a cerebrospinális folyadékban vannak gram-pozitív cocci-k, az orvos az erre a célra kidolgozott protokollok szerint az antibiotikumokkal kezdi a kezdeti kezelést az ilyen típusú baktériumok kiküszöbölésére.

Amint megkapja a végeredményt az izolált mikroorganizmus nevével és annak megfelelő anti-programjával, az orvos megvizsgálja, hogy megváltoztatja-e a terápiát. Ezt a döntést a kapott mikroorganizmusok érzékenységének és a beteg fejlődésének vizsgálata alapján hozzák meg.

bázis

Ez egy technika, amelynek 4 alapvető lépése van: festés, rögzítés a peremmel, elszíneződés és ellenfestés. Ezért ez a technika a baktériumok színezésén kívül lehetővé teszi azok megkülönböztetését is.

A kristályibolya az első színezőanyag. Affinitással rendelkezik a peptidoglikán iránt, és megfesti az összes jelenlévő baktériumot lila színűre, majd a lugolt elhelyezi, amely szivárgásként működik, azaz oldhatatlan kristályibolya-jód komplexek - ribonukleáris fehérjék - képződését indukálja a sejtben..

A vastag peptidoglikánfalú gramm pozitív baktériumok sokkal komplexeket képeznek (kristályibolya-jód), ezért megtartják a festéket.

Ezenkívül az is befolyásolja, hogy a Gram-pozitív baktériumok fala nagyobb mennyiségű telítetlen savat tartalmaz, amelyek nagy affinitást mutatnak az oxidálószerekkel (Lugol) szemben.

Eközben a gram-negatív baktériumok vékony rétegű peptideklikánnal rendelkeznek, ami miatt a baktériumok kevésbé komplexeket képeznek, mint a gram-pozitív baktériumok.

Ezután következik a elszíneződés lépése, ahol a gram-pozitív és a gram-negatív baktériumok eltérően viselkednek.

A gram-negatív baktériumok lipopoliszacharidokban gazdag külső membránt tartalmaznak, amely része a sejtfalnak. A zsírok az aceton-alkohollal érintkezve elpusztulnak, így a külső membrán destabilizálódik, felszabadítva az ibolya kristályt.

Így lehet ezt ellensúlyozni szafraninnal vagy bázikus fuksinnal, pirosra váltva.

Gram-pozitív baktériumok esetén ellenállnak a fakulásnak, mivel a fehérítő a pórusok bezárásával működik, ami megakadályozza a kristályibolya / jód komplex kiszivárgását.

Ezért a kristály ibolya színű színe stabil marad, és nincs helye szafraninnak vagy fuksinnak. Ez az oka annak, hogy ezek a baktériumok mélykékre vagy lilara festenek.

anyagok

A Gram festőkészlete a következőkből áll:

• Lila üveg
• Lugol
• Aceton alkohol
• Szafranin vagy bázikus fuksin

Festékek és reagensek előállítása

Kristály lila oldat

Megoldás:

Lila kristály ------------- 2 gr

95% etil-alkohol ---------- 20 cc

B megoldás:

Ammónium-oxalát ----------- 0,8 gr

Desztillált víz ------------- 80 cm3

A kristályibolya végső elkészítéséhez az A oldatot desztillált vízzel 1:10 arányban hígítani kell és 4 rész B oldattal össze kell keverni. A keveréket felhasználás előtt 24 órán át tárolják. Szűrje egy sárga színű palackba szűrőpapírral.

A napi felhasználandó mennyiséget áthelyezzük egy borostyáncseppek üvegébe.

Jód-Lugol

Mérjük meg és mérjük meg az egyes vegyületek feltüntetett mennyiségét az alábbiak szerint:

Jódkristályok ------------- 1gr

Kálium-jodid ------------- 2gr

Desztillált víz ------------- 300 cm3

A kálium-jodid apránként oldódik a vízben, majd a jódot adják hozzá. Az oldatot borostyán üvegbe borotváljuk.

A napi felhasználásra kerülő mennyiséget csepegtetővel áthelyezzük egy kisebb borostyánpalackba.

Fehérítés

95% etil-alkohol -----------– 50 ml

Aceton ------------------ 50 ml

Készül el egyenlő részben. Fedje le jól, mivel hajlamos elpárologni.

Helyezzen egy csepegő üvegbe.

Ez a készítmény mérsékelt időben, 5-10 másodperc alatt elszíneződik, és ez a leginkább ajánlott.

A kezdők inkább csak 95% etil-alkoholt használnak, ahol a fakulás 10-30 másodpercnél lassabb.

Míg a tapasztaltabb használhat tiszta acetont, ahol a elszíneződés nagyon gyorsan történik 1-5 másodpercig.

Kontraszt

Szafranin törzsoldat

Safranina -------------– 2,5 gr

95% etil-alkohol --------– 100 cm3

A megadott mennyiségű szafranin mérlegelése után feloldjuk 100 ml 95% etil-alkoholban.

A működő szafranin oldatot a törzsoldatból készítjük.

Ehhez mérje meg 10 cm3 törzsoldatot, adjon hozzá 90 cm3 desztillált vizet, hogy 100 ml-t kapjon.

Ajánlott a napi felhasználandó mennyiséget átvinni egy csepegtetővel ellátott borostyánpalackba.

Azok a mikroorganizmusok, amelyek gyengén Gram-negatív festést mutatnak a Gram-Hucker festékkel, mint például bizonyos anaerobok, Legionella sp, Campylobacter sp és Brucella sp, sokkal jobban megfesthetők Kopeloff által a Gram-Hucker festék módosításával, az úgynevezett Gram-Kopeloff folt.

Ez a módszer megváltoztatja a szafranin festéket bázikus fuksinná. Ezzel a módosítással hatékonyan színezhetők a fent említett mikroorganizmusok.

Reagens tárolása

Az elkészített színezékeket szobahőmérsékleten kell tárolni.

A színezhető minta kenetének előkészítése

Egy mintát tartalmaznia kell legalább 10 ⁵ mikroorganizmusok előtt megfigyelése a mikroorganizmus egy kenetben valószínű. A kenet elkészíthető közvetlen mintából vagy tenyészetekből szilárd vagy folyékony közegben.

A kenetnek egységesnek, jól eloszlatottnak és nem túl vastagnak kell lennie a jelenlévő struktúrák jobb megjelenítéséhez.

-Gramma közvetlen mintákat

Gramm centrifugálatlan vizelet

A vizeletet összekeverik, és 10 ul-t a lemezen helyeznek. Legalább egy baktérium / Dip mező megfigyelése azt jelzi, hogy fertőzés van.

Ez azt jelenti, hogy a tenyészet lesz körülbelül több, mint 100.000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / ml) a vizelet 85% -a volt.

Ez a módszer nem használható 100 000 CFU alatti kolóniaszám esetén.

CSF Gram

A CSF-et centrifugálni kell, a felülúszót el kell távolítani, és a pellet el kell helyezni a lemezen. Ez a folyadék normál körülmények között steril; a baktériumok megfigyelése fertőzést jelez.

Gramma légzésminták

A köpet, hörgő vagy bronchoalveoláris mosás Gram, bár lehet, hogy különféle mikroorganizmusok léteznek, mindig a diagnózist irányítja, amellett, hogy hasznos a megfigyelt sejttípusokon.

A köpet esetében a kenet elkészítését a minta legtisztább részével kell elvégezni.

Egy gramm széklet

Nem ajánlott Gram elvégzése az ilyen típusú mintákon, mivel ennek nincs diagnosztikai értéke.

-Gram növények

Kétféle módon végezhetők el, az egyik folyékony és a másik szilárd kultúrákból.

Folyékony tenyészetek

A folyékony tenyészetekből rendkívül egyszerű; A zavaros húslevest több sütőjét az égő alá veszik, és egy tiszta és száraz lemezen helyezik, és kör alakú mozdulatokat hajtanak végre a középről a periféria felé az anyag egyenletes eloszlása ​​érdekében.

Hagyja, hogy spontán módon megszáradjon a levegőben. Miután megszáradt, az anyagot hővel rögzítik a lapra. Ehhez csipesz segítségével a lemezt 3-4 alkalommal vezetik át a Bunsen égő lángján, ügyelve arra, hogy az anyag ne égessék el.

A lapot hagyjuk lehűlni, és a színező hídra helyezzük.

Szilárd növények

A szilárd tenyészetből származó Gram-folt kenetének elvégzéséhez tegye a következőket:

Mielőtt kiválasztanák a veendő telepeket, a tárgylemezt el kell készíteni, hozzávetőleg két csepp steril fiziológiás sóoldatot adva.

Ha az eredeti tenyésztőlemez több különféle típusú kolóniát tartalmaz, akkor a gram elvégzéséhez mindegyikének izolált kolóniáját választják. Minden kolóniát a platinahurokkal veszünk fel, hogy feloldódjon a korábban a tárgylemezen elhelyezett sóoldatban.

Körkörös mozdulatokat hajtunk végre középről a periféria felé, hogy a kolónia egyenletesen eloszljon a lemezen.

Hagyja, hogy spontán módon megszáradjon a levegőben. Miután megszáradt, a lemezt hővel rögzítik, amint azt korábban kifejtettük (a tárgylemezt lángolóval lángolva), ügyelve arra, hogy az anyag ne égessék el.

Ezt az eljárást mindenféle kolónia típusával meg kell végezni. Egy darab papíron meg kell jegyezni a megfigyelt sorrendjét, például:

1. kolónia: Béta-hemolitikus sárga kolónia: Gram-pozitív cocco-kat figyeltek meg klaszterekben

2. kolónia: krémszínű kolónia, hemolízis nélkül: Gram-negatív coccobacillusokat figyeltünk meg.

Minden diát meg kell jelölni, hogy tudjuk, mit figyelünk.

Technika

A Gram festési technika rendkívül egyszerűen elvégezhető és viszonylag olcsó, és nem szabad kihagyni egy mikrobiológiai laboratóriumban.

Ez a következőképpen történik:

1. Rögzítse a kenet hővel és helyezze a festőhídra.
2. Fedje le teljesen a tárgylemezt 1 percig kristály violettel.
3. Mossa le vízzel Ne szárítsa meg
4. Fedjük le a lapot lugol oldattal, hagyjuk 1 percig hatni. Mossa le vízzel Ne szárítsa meg.
5. Fehérítse 5-10 másodpercig enyhén rázva alkoholos acetonban. Vagy helyezze a lemezt függőleges helyzetbe és csepegtesse le a színtelenítőt a felületre, amíg a visszamaradt ibolya üveg feleslege eltávolításra nem kerül. Ne haladja meg.
6. Mossa le vízzel Ne szárítsa meg.
7. Cserélje ki a lemezt a festőhídon, és takarja le 30 másodpercig szafraninnal (Gram-Hucker) vagy 1 percig bázikus fuksinnal (Gram-Kopeloff).
8. Mossuk le vízzel
9. Hagyja, hogy függőleges helyzetben spontán módon megszáradjon.

Szárítás után tegyen 1 csepp merülőolajat, hogy megfigyelje azt a fénymikroszkópban a 100X objektív alatt.

Hasznosság

Ez a módszer lehetővé teszi a legtöbb baktérium morfotintorális különbségeinek megkülönböztetését.

Az élesztőket szintén megkülönbözteti ez a szín. Fogják a kristály ibolya, vagyis festenek gram-pozitív képet.

Másrészt megkülönböztethetők a spóraképző grampozitív rudak, amelyekben tiszta teret figyelnek meg a bacilluson belül, ahol az endospóra képződött, bár a spórák nem festenek jól. Más technikákat, például a Shaeffer-Fultont használnak a spórafestéshez.

Meg kell jegyezni, hogy ezt a festést nem használják minden típusú baktérium színezésére, vagyis vannak olyan esetek, amikor a festés nem működik.

Ebben az esetben megemlíthetjük azokat a baktériumokat, amelyekben nincs sejtfal. Például: Mycoplasma nemzetség, szferoplasztok, ureaplasma, L-formák és protoplasztok.

Nagyon rosszul festi a baktériumokat a mikolsavakban gazdag falakkal, mint például a mikobaktériumokkal, és az intracelluláris baktériumokkal, például a Chlamydias és Rickettsias baktériumokkal.

Ezenkívül hatástalan a legtöbb spirochetalis baktérium festésében is.

Vannak ugyanabba a nemzetségbe tartozó baktériumok, amelyek megfigyelhetők ugyanabban a mintában, mint a gram-pozitív és a gram-negatív. Amikor ez megtörténik, változó Gram-foltnak nevezik, amelynek oka a tápanyagok, a hőmérséklet, a pH vagy az elektrolitkoncentráció megváltozása lehet.

Gyakori hibák

Túlzott fehérítés

A elszíneződés túlságosan hamis gram-negatív mikroorganizmusok megfigyeléséhez vezethet.

A várakozási idő nem elég hosszú ahhoz, hogy bemerítse a merülő olajat

Gram-pozitív baktériumokat okozhat a Gram-negatív (hamis Gram-negatív) elszíneződéséhez. Ennek oka az, hogy a régi kultúrákban valószínűleg elpusztult vagy elrontott baktériumok vannak, és ezekben a körülmények között a baktériumok nem tartják meg a kristályibolya-t.

Használjon nagyon régi lugol oldatot:

Az idő múlásával a lugol elveszíti tulajdonságait, és színe elhalványul. Ha a már degenerált reagenst használják, akkor nem rögzíti a kristályibolya jól, ezért lehetőség van hamisan gramm negatív mikroorganizmusok megjelenítésére.

Kék háttér

A megfelelően elszíneződött háttér piros színű lesz. A kék háttér azt jelzi, hogy a elszíneződés nem volt elegendő.

Irodalom

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Orvosi mikrobiológia, 6. kiadás, McGraw-Hill, New York, USA
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiológiai diagnózis. (5. kiadás). Argentína, szerkesztõ Panamericana SA
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott mikrobiológiai diagnosztika. 12 ed. Argentína. Szerkesztő Panamericana SA
4. Casas-Rincón G. 1994. Általános mikológia. Venezuelai Központi Egyetem 2. kiadása, könyvtári kiadások. Venezuela Caracas.
5. "Gram-festés." Wikipédia, a szabad enciklopédia. 2018. október 4., 23:40 UTC. 2018. december 9., 17:11. Átvett az es.wikipedia.org oldalról.
6. González M, González N. 2011. Orvosi mikrobiológiai kézikönyv. 2. kiadás, Venezuela: A Carabobo Egyetem média és kiadványai Igazgatósága.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Alapvető foltok a mikrobiológiai laboratóriumban. Kutatás a fogyatékossággal kapcsolatban. 2014 3 (1): 10-18.