FOSZFÁTPUFFER (TÖMEG): INDOKLÁS, ELŐKÉSZÍTÉS ÉS FELHASZNÁLÁSOK - BIOLÓGIA - 2025

A foszfátpuffer, foszfáttal pufferolt sóoldat vagy BPS izotóniás puffer, amelynek feladata a pH és az ozmotikus nyomás fenntartása a természetes biológiai környezethez (fiziológiáshoz) közel. A PBS rövidítés a foszfáttal pufferolt sóoldatot jelenti.

A PH és az ozmolaritás két nagyon fontos szempont, amelyeket bizonyos laboratóriumi protokollokban ellenőrizni kell. A pH esetén elengedhetetlen annak szabályozása, különösen a biokémiai reakciók során, mivel ezek változhatnak, vagy nem hajthatók végre, ha a reagensek pH-ja nem megfelelő.

PBS foszfáttal pufferolt sóoldat két különböző pH-n. Forrás: Pixinio.com

Ugyanakkor az ozmolaritás ellenőrzése alapvetően fontos, ha élő sejtekkel dolgozunk, mivel a sejtek plazmamembránjai az oldott anyag koncentrációja szerint reagálnak, amelyben megtalálhatók.

Ha a sejteket átviszik egy hipertóniás közegbe, akkor azok kiszáradnak, mivel a vízgradiens arra az oldalra szállul, ahol az oldott anyagok nagyobb koncentrációja van. Ha viszont a sejteket hipotóniás közegbe helyezik, akkor a sejtek felszívják a folyadékot, amíg lizálódnak.

Ezért használják a PBS puffert laboratóriumi protokollokhoz, amelyek megkövetelik a sejtek in vitro fenntartását, így a sejtek nem lesznek sérültek.

A PBS sók, például nátrium-klorid, nátrium-foszfát, kálium-klorid és kálium-foszfát kombinációjából áll. A PBS összetétele a protokolltól függően változhat.

bázis

A foszfát-puffer alapvetõen állandó fiziológiás pH-értéket tart fenn a test belsejéhez hasonló elektrolitkoncentrációval együtt.

Ebben a környezetben a sejtek stabilak maradhatnak, mivel a fiziológiai feltételeket a lehető legnagyobb mértékben szimulálják.

Más vegyületeket adhatunk az eredeti PBS készítményhez, ha szükséges, például az EDTA hozzáadása a pufferhez hasznos a vörösvértestek mosására a keresztkompatibilitási tesztben.

Az EDTA megakadályozza, hogy a szérumban lévő C1 komplement frakció hasadjon és lizálódjon a vörösvértestekbe, vagyis elkerüli a hamis összeférhetetlenség eredményeit. Ezen felül az EDTA segít a sejtek disszociációjában.

Készítmény

A PBS-foszfáttal pufferelt sóoldat elkészítéséhez mérlegelendő sók mennyisége az előkészítendő mennyiségtől függ:

-Foszfáttal pufferolt sóoldat törzsoldat (10x PBS)

Egy liter oldathoz:

Mérni:

80,6 g NaCl,

2,2 g KCl, 11,5 g Na ₂ HPO ₄, 2,0 g KH ₂ HPO ₄

Előkészítési technika

Helyezzük a nehéz sókat egy főzőpohárba, adjunk hozzá elég vizet (80%) és keverjük a keverőlapon mágneses rudakkal, amíg a sók fel nem oldódnak.

A PBS előállítása keverőlemez segítségével mágneses rudazattal. Forrás: Felhasználó: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Szűrjük le az oldhatatlan részecskék eltávolítására. Használjon 0,45 μm pórusú szűrőket. Autokláv és aszeptikus módon szétoszlatva egy lamináris áramlású burkolatban üvegedényekben, fedővel.

A tömény 10x oldat nem állítja be a pH-t. A beállítást elvégezzük az 1x PBS puffer koncentrációra hígítva (1:10 hígítás).

-Suffer foszfát sóoldat (1X PBS)

Az 1x PBS-t közvetlenül el lehet készíteni, megmérve az egyes sók megfelelő mennyiségét, vagy előállíthatjuk úgy, hogy a törzsoldatot (1:10) steril desztillált vízzel meghígítjuk.

- Egy liter 1x PBS-foszfátpufferolt sóoldat közvetlen elkészítéséhez mérjük meg:

8,06 g NaCl, 0,22 g KCl, 1,15 g Na ₂ HPO ₄, 0,20 g KH ₂ HPO ₄

Előkészítési technika

A koncentrált oldatban leírtak szerint járjon el. Ezt követően a pH-t beállítani kell. Ehhez mérje meg a pH-t, és az eredménytől függően használjon savat (HCl) vagy bázist (NaOH) a pH csökkentéséhez vagy emeléséhez, ha szükséges, 7,4-ig.

A savat vagy a bázist cseppenként adagoljuk, miközben az oldat pH-értékét pH-mérővel ellenőrizzük. Szűrjük, autoklávot készítünk, és aszeptikusan szétoszlatjuk kúpos csövekbe vagy edényekbe, ha szükséges.

- 1X PBS készítése a 10X törzsoldatból:

Készítsen 1:10 hígítást. Például 1 liter 1x PBS készítéséhez mérjünk ki 100 ml törzsoldatot és adjunk hozzá 700 ml steril desztillált vizet. Állítsa be a pH-t, és töltse fel a vízmennyiséget 1000 ml-ig.

Az elkészített PBS puffer színtelen és tiszta.

A napi PBS-t szobahőmérsékleten, a többi hűtőszekrényben tárolhatja.

Megoldások a pH beállításához

HCl

100 ml 1 mólos sósavhoz (sósav).

Mérjünk meg 91 ml desztillált vizet és helyezzük egy 250 ml-es főzőpohárba.

Mérjünk be 8,62 ml koncentrált sósavat, és lassan adagoljuk a vizet tartalmazó főzőpohárba (soha ne csináljuk fordítva). Erős savak (erősen maró hatású anyagok) kezelésekor hajtsa végre a megfelelő biológiai biztonsági intézkedéseket.

Keverjük össze 5 percig, lehetőleg keverőlemez segítségével, az üveg belsejében lévő mágneses rudakkal. Tegyük át egy 100 ml-es lombikba, és töltsük fel 100 ml-re desztillált H ₂ O.

NaOH

100 ml 10 mólos NaOH (nátrium-hidroxid) oldathoz.

Mérjünk be 40 ml desztillált vizet és helyezzük egy 250 ml-es főzőpohárba. Mérjünk be 40 g NaOH-t és adjunk hozzá a vízhez. Keverjük össze keverőlemez segítségével és az üveg belsejében egy mágneses rudazattal.

Helyezzük egy 100 ml-es mérőpalackba, és töltsük fel jelig desztillált vízzel. Vegye figyelembe a biobiztonsági előírásokat, mivel ez a reakció exoterm (hő formájában energiát bocsát ki).

Ha más mennyiségű foszfát-sóoldatot kíván készíteni, olvassa el az alábbi táblázatot:

Forrás: «Vírus- és emberi genomika laboratóriuma, UASLP Orvostudományi Iskola»

Alkalmazások

Elsősorban a sejtbiológiában, immunológiában, immunhisztokémiában, bakteriológiában, virológiában és kutató laboratóriumokban használják.

Ideális sejtek centrifugálással (vörösvérsejtek) történő mosására, sejtrétegek egyszeri mosására, spektroszkópikus ellipszometriás technikákban, a baktérium-biofilmek mennyiségi meghatározásában, a sejttenyészetek fenntartásában a vírusok számára, mosóoldatként közvetett immunfluoreszcencia technikában és a monoklonális antitestek jellemzésére szolgáló technikákban.

Használják továbbá sejtek vagy szövetek szállítására, hígítószerként a sejtek számlálására, celluláris enzimek (tripszin) előállítására, hígítószerként a biomolekulák kiszáradási módszerére és más reagensek előállítására.

Másrészről, Martin és munkatársai 2006-ban bebizonyították, hogy a PBS hasznos a kriminalisztikai laboratóriumokban, különösképpen a sperma regenerálódásában a hüvelyi kenetből, vagy a hüvelyi sejteknek a péniszkenderből történő visszaszerzésében. Ily módon megállapítható, hogy volt-e szexuális kapcsolat.

korlátozások

- Néhány PBS puffer tartósítószerként nátrium-azid nevű anyagot tartalmaz. Ez a vegyület robbanásveszélyes anyagokat hozhat létre, ha ólommal vagy rézrel érintkezik. Ezért különös figyelmet kell fordítani, ha ezt a reagenst a csatornába engedik. Ha így ártalmatlanítják, akkor sok vizet kell hozzáadagolni, hogy a lehető legnagyobb mértékben hígítsák.

- A cinket nem szabad hozzáadni a foszfátpufferhez, mivel ez bizonyos sók kicsapódását okozza.

-Wangen és munkatársai 2018-ban megállapították, hogy a PBS nem volt alkalmas perifériás vérből kivont akut mieloid leukémia (AML) primer sejtjeinek mosására, mivel sok sejt elveszti a lízist, az anyag nagymértékű csökkenésével fehérje.

Ezért úgy határoztak, hogy a primer AML-sejteket nem szabad mosni PBS-sel PBS-sel való folyékony nitrogénben való tárolás után.

Irodalom

1. Coll. J. (1993). Diagnosztikai technikák a virológiában. Ed Díaz de Santos. 360 oldal
2. Rodríguez M, Ortiz T. Sejttenyészet. Közepes változás. A Sevilla Egyetemi és Patológiai Citológiai és Szövettani Tanszék. Elérhető a personal.us.es oldalon
3. Foszfátpufferolt sóoldat (PBS) előállítása. (2008). Szabványos működési eljárások (SOP) Humán és Vírusgenomikai Laboratórium, UASLP Orvostudományi Iskola. Elérhető a következő címen: genomica.uaslp.mx
4. "Foszfát puffer sóoldat." Wikipédia, a szabad enciklopédia. 2019. április 3., 19:36 UTC. 2019. április 13., 02:57 en.wikipedia.org.
5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C. A molekuláris biofizika témái. Elérhető a következő oldalon: users.df.uba.ar
6. Rediar. Kézikönyv. PBS + EDTA. Elérhető a felsan.com.ar oldalon
7. Martin NC, Pirie AA, Ford LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG. Foszfáttal pufferolt sóoldat felhasználása sejtek és spermatozoidok tamponokból történő kinyerésére. Sci Justice. 2006; 46 (3): 179-84. Elérhető itt: ncbi.nlm.nih.gov
8. Wangen R, Aasebø E, Trentani A és mtsai. A konzerválási módszer és a foszfáttal pufferolt sóoldat mosása befolyásolja az akut myeloid leukémia proteomát. Int. J. Mol. Sci. 2018; 19 (1): 296. Elérhető itt: ncbi.nlm.nih.gov
9. Martínez R, Gragera R. (2008). A hisztokémia elméleti és gyakorlati alapjai. Tudományos Vizsgálatok Felső Tanácsa. Madrid. Elérhető a következő címen: books.google.co.ve