IMMUNFLUORESZCENCIA: INDOKLÁS, PROTOKOLL ÉS ALKALMAZÁSOK - BIOLÓGIA - 2026

Az immunfluoreszcencia egy erőteljes immunfestési módszer, amelynek során fluoreszcens molekulákhoz kovalensen kötött antitesteket alkalmaznak a szilárd hordozóra rögzített sejtminták specifikus célpontjainak azonosítására.

Ez a módszer magában foglalja az immunológiai specifitású mikroszkópos megfigyelést, lehetővé téve az élő vagy elhalt sejtek megfigyelését, amelyek minimális mennyiségű antigént tartalmazhatnak. Széles körben használják a kutatások területén és a különféle patológiák klinikai diagnosztizálásában.

Aktin filamentumok immunjelölése kardiomiocita sejtekben (Forrás: Ps1415 a Wikimedia Commons segítségével)

Ez a technika, elsősorban kvalitatív (néhány kvantitatív variációval), egy mintának a fluoreszcens termékjel általi megjelenítésével kapcsolódik, amely egy ellenanyaghoz kötött fluoreszcens molekula, amely egy bizonyos hullámhosszon képes gerjeszteni..

Sejtes kontextusban nagyon hasznos a fehérjék jelenlétének / hiányának és szubcelluláris elhelyezkedésének tanulmányozása. A technikát kezdetben klinikai körülmények között alkalmazták vírusok, például influenza diagnosztizálására, majd sok más fertőző betegség kezelésére.

Nagyon érzékeny technika, és a megfelelő mikroszkópos berendezéssel nagyon jó felbontású lehet. Megfigyeléséhez konfokális vagy epifluoreszcencia mikroszkópok használatát igényli.

Annak ellenére, hogy nagyon népszerű, számos fontos problémát jelenthet a nem specifikus fluoreszcencia előállításával kapcsolatban, amely némi háttérzajt generál, ami gyakran korlátozza az eredmények megfelelő leolvasását.

bázis

Az immunfluoreszcencia az antitest és az antigén közötti kölcsönhatási reakció biológiai jelenségének kiaknázásán alapul. Ez kifejezetten ennek a reakciónak a megjelenítésével vagy detektálásával kapcsolódik izgalmas fluoreszcens molekulák által egy adott hullámhosszig.

Az antitest egy aktív B-sejtekből szekretált immunoglobulin protein, amelyet specifikusan generálnak egy antigén ellen, amelyhez nagy affinitással és specifitással kötődik. Az immunfluoreszcencia IgG immunoglobulinokat használ fel, amelyek a vérszérumban oldódnak.

Az ellenanyagok olyan molekulák, amelyek 950 kDa-ig terjednek, két rövid (könnyű) és két hosszú „Y” alakú (nehéz) peptidláncból állnak. Mind a könnyű, mind a nehéz lánc két doménre oszlik: az egyik változó képes felismerni az antigént, a másik állandó vagy konzervált, az egyes fajokra jellemző.

Az antigének funkcionálisan molekulákként vannak meghatározva, amelyeket egy antitest felismerhet, és amelyek nagyrészt fehérjék. Amikor egy állat antigénnek van kitéve, aktiválódnak az immunrendszer limfocitái, amelyek specifikus antitesteket termelnek ellene, és ezek védelmi rendszerként működnek.

Egy antigénnek, például egy fehérjenek lehet egynél több epitópja vagy egy antitest által felismerhető hely, tehát az antigénnek kitett állat szérumában poliklonális antitestek lehetnek ugyanazon fehérje különböző régióival szemben.

Az immunfluoreszcencia ezután kihasználja az állat azon képességét, hogy poliklonális antitesteket állítson elő egy specifikus antigén ellen annak tisztítása és felhasználása céljából ugyanazon antigén más helyzetekben történő kimutatására.

Az egyes immunfluoreszcencia-technikákhoz leginkább használt fluoreszcens festékek vagy molekulák között megtalálhatók a fluoreszcein-izotiocianát (FITC), a tetrametil-rodamin-izotiocianát-5 és 6 (TRITC), számos cianin, például Cy2, Cy3, Cy5 és Cy7, valamint az Alexa Fluor® nevű festékek., például az Alexa Fluor®448.

Jegyzőkönyv

Az immunfluoreszcencia-protokoll sok tényezőtől függően változik, azonban általánosságban véve magában foglalja a következő lépésekből álló lineáris lépéssort:

• A lemezek és sejtek előkészítése
• A minták rögzítése
• Permeabilizációs
• blokkolása
• Immunfestés vagy immunfestés
• Összeszerelés és megfigyelés

-Készítmény

A minták közül

A minták előkészítése a természetétől és a végrehajtandó tapasztalatok típusától függ. Az alábbiakban ismertetjük a legegyszerűbb esetet, amely a sejtek szuszpenzióban történő felhasználását foglalja magában.

A szuszpenzióban lévő sejteket, azaz folyékony tenyésztő tápközegben először centrifugálással kell elválasztani, majd pufferoldattal vagy izosmotikus "pufferrel" mossuk, amely megőrzi integritását.

Általában PBS néven ismert foszfát-só-puffert használunk, amelyben a sejteket újraszuszpendáljuk, és ezt a keveréket ismét centrifugáljuk, hogy a sejteket mentesítsük a tápközegtől, amely zavaró anyagokat tartalmazhat.

A pengék közül

A mikroszkópos megfigyeléshez használt lemezeket, ahol a sejteket később rögzítik a megfelelő downstream kezelésekhez, szintén gondosan el kell készíteni.

Ezeket bevonják vagy "szenzibilizálják" polilizin oldattal, egy szintetikus polimerrel, amely "molekuláris ragasztóként" fog működni a sejtek és a szilárd hordozó között, köszönhetően az aminocsoportjaik pozitív töltései és a sejtek közötti elektrosztatikus kölcsönhatásnak. negatív töltések a sejteket borító proteinekre

A minták rögzítése

Ez a folyamat a sejtben található fehérjék immobilizálásából áll, hogy megőrizhessék térbeli helyüket. Az alkalmazott molekuláknak képesnek kell lenniük minden típusú sejtmembrán átlépésére és rácsok kialakítására a kovalens fehérjékkel.

Széles körben használják a formaldehidet és a paraformaldehidet, a glutaraldehidet és még a metanolt is, amelyekkel a sejtmintákat egy ideig inkubálják, majd izosmotikus pufferoldattal mossák.

A sejtek rögzítése után továbbra is hozzákapcsolódnak a korábban poli-lizinnel szenzibilizált lemezekhez.

Permeabilizációs

Az elvégzendő vizsgálat típusától függően szükség lesz a vizsgált sejtek permeabilizálására, vagy sem. Ha arra törekszünk, hogy megismerjük egy bizonyos fehérje helyét, jelenlétét vagy hiányát a sejt felületén, akkor a permeabilizáció nem szükséges.

Másrészt, ha meg akarja tudni a fehérje helyét a sejtben, akkor a permeabilizáció elengedhetetlen, és a mintákat inkubáljuk a Triton X-100-tal, egy olyan tisztítószerrel, amely képes a sejtmembránok permeabilizálására.

blokkolása

Az immunológiai technikák alapvető lépése a blokkolás. Az eljárás ezen szakaszában a blokkolás abból áll, hogy az érzékenyített lemezeken az összes helyet lefedik poli-lizin molekulákkal, amelyekhez a sejtek nem tapadtak. Vagyis megakadályozza a nem specifikus uniókat.

Általában a szarvasmarha-szérumalbumin (BSA) oldatok PBS-pufferben történő blokkolására használják, és a legjobb eredményeket minél hosszabb az inkubációs idő ezzel az oldattal. Minden egyes lépés után, beleértve a blokkolást is, le kell mosni a fennmaradó oldatot.

Immunfestés vagy immunfestés

Az immunfestés vagy immunfestés elsősorban attól függ, hogy közvetlen vagy közvetett immunfluoreszcencia-e (lásd alább).

Ha ez primer vagy közvetlen immunfluoreszcencia, akkor a mintákat a kívánt antitestekkel inkubálják, amelyeket össze kell kapcsolni a fluoreszcens festékekkel. Az inkubációs eljárás abból áll, hogy az ellenanyagot olyan oldatban hígítjuk, amely szintén tartalmaz BSA-t, de kisebb arányban.

Ha ez a helyzet egy másodlagos vagy közvetett immunfluoreszcencia, két egymást követő inkubációt kell végrehajtani. Először a kívánt antitestekkel, majd az antitestekkel, amelyek képesek az elsődleges immunglobulinok állandó régióinak kimutatására. Ezek a szekunder antitestek kovalensen kötődnek a fluoroforokhoz.

A technika nagyon sokoldalú, lehetővé téve mintánként egynél több antigén egyidejű címkézését, feltéve, hogy közvetlen immunfluoreszcencia esetén vannak különböző fluoreszorákhoz kapcsolt primer antitestek.

Az indirekt immunfluoreszcencia egyidejű címkézéséhez biztosítanunk kell, hogy minden primer antitest egy másik állatban termelődjön, valamint hogy minden szekunder antitest eltérő fluoroforhoz kapcsolódjon.

Mint a blokkolás, az antitestekkel történő inkubálás jobb eredményeket ad, minél hosszabb az idő. Minden egyes lépés után meg kell mosni a fölösleges antitesteket, amelyek nem kötődtek a mintákhoz, és a szekunder immunfluoreszcencia során blokkolni kell a szekunder antitest hozzáadása előtt.

Egyes technikák más foltokat is használnak, amelyek nem kapcsolódnak az immunfestéshez, például a nukleáris DNS festését a DAPI fluoroforral.

Összeszerelés és megfigyelés

A fluoroforokkal végzett utolsó inkubációs idő alatt szükséges, hogy a minták sötétben maradjanak. A mikroszkóp alatt történő megfigyeléshez gyakran használnak bizonyos anyagokat az antitestekhez kapcsolt fluoreszcens fluoreszcencia megőrzésére.

típusai

A közvetlen és közvetett immunfluoreszcencia grafikus összefoglalása (Forrás: Westhayl618 a Wikimedia Commons segítségével)

Közvetlen vagy primer immunfluoreszcencia

Az antigének fluoreszcens antitestek felhasználásával történő kimutatásával kapcsolatos. Ennek a módszernek a fő előnye a sebessége, azonban a nem-specifikus kötődés sok esetben előfordulhat, különösen az emberi szérumok vizsgálatakor, mivel ezek gazdagok nagyon heterogén antitestekben.

Közvetett vagy szekunder immunfluoreszcencia

Szendvics technikaként is ismert, és ez magában foglalja a technika két lépésben történő kidolgozását. Az első a nem fluoreszcens antitest felhasználásával és annak megkötésekor kapcsolódik a kérdéses antigénhez.

Ennek az első antitestnek (amely immár antigénként szolgál) állandó régiójával szemben egy másik, annak felismerésére képes ellenanyagot alkalmazunk, amely egy fluoreszcens molekulával van társítva.

A fluoreszcens jel megjelenése az első nem fluoreszcens antitest és a kérdéses antigén közötti specifikus felismerés eredménye; az első ellenanyag jelenléte feltételezi a jelölt második antitest jelenlétét, amelynek köszönhetően az antigén jelenléte vagy hiánya meghatározható.

Annak ellenére, hogy sokkal időigényesebb módszer, mint a közvetlen immunfluoreszcencia (mivel ez magában foglal egy további inkubációs lépést), ez a módszer nem foglalja magában fluoreszcens antitest tervezését minden egyes vizsgált antigénhez, ami gazdasági szempontból eredményes életképesebb.

Ezenkívül ez egy érzékenyebb technika a jel amplifikációja szempontjából, mivel egynél több szekunder antitest kötődik az elsődleges antitest állandó régiójához, ezáltal erősítve a fluoreszcens jel intenzitását.

Alkalmazások

Mint korábban már megjegyeztük, az immunfluoreszcencia rendkívül sokoldalú technika, amelyet sokféle módon alkalmaznak a tudományos és klinikai területeken. Használható sok organizmusra vonatkozó ökológiai, genetikai és élettani kérdések megválaszolására.

A klinikai alkalmazások közül bizonyos dermatológiai betegségek közvetlen diagnosztizálására alkalmazzák, akár közvetlen, akár közvetett immunfluoreszcenciával a vizsgált betegek hámszövetén.

Immunfluoreszcencia technikák állnak rendelkezésre egysejtű szervezetekben, például élesztőben az intranukleáris és citoplazmatikus mikrotubulusok, aktin és társult fehérjék, 10 nm filamentumok, valamint a citoplazma, membrán és sejtfalak más alkotóelemeinek megjelenítésére.

Irodalom

1. Abcam, immuncitokémia és immunfluoreszcencia protokoll. Visszakeresve az abcam.com webhelyről
2. Greph, C. (2012). Fluoreszkáló festékek. Visszakeresve a leica-microsystems.com webhelyről
3. Miller, DM, és Shakest, DC (1995). Immunfluoreszcencia mikroszkópia. In Methods in Cell Biology (48. kötet, 365–394. Oldal). Academic Press, Inc.
4. Odell, ID, és Cook, D. (2013). Immunfluoreszcencia technikák. Journal of Investigative Dermatology, 133, 1–4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG, és Brian, K. (1991). Élesztő immunfluoreszcencia módszerei. In Methods of Enzymology (194. kötet, 565–602. Oldal). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, E. V. és Widelock, D. (1964). Az immunfluoreszcencia alkalmazása a közegészségügyi virológiában. Bakteriológiai áttekintés, 28. (4), 402–408.
7. Vrieling, EG és Anderson, DM (1996). Immunfluoreszcencia a fitoplankton kutatásban: alkalmazások és potenciál. J: Phycol., 32, 1–16.