SZABVÁNYOS AGAR GYÖNGY: INDOKLÁS, ELŐKÉSZÍTÉS ÉS FELHASZNÁLÁS - BIOLÓGIA - 2025

A standard agar egy szilárd, nem szelektív táptalaj, amelyet az ivóvíz, a szennyvíz, a tejitalok mintáiban és az egyéb élelmiszerekben található aerob mikrobiális terhelés mennyiségi meghatározására terveztek. Ez a táptalaj PCA-agar néven is ismert, rövidítésként az angol Plate Count Agar-ban. 1953-ban Buchbinder, Baris és Goldstein készítette.

A standard agar tápközeg élesztő-extraktumból, tripteinből, glükózból, agarból és desztillált vízből áll. Ez a készítmény alapvető táplálkozási elemeket tartalmaz, amelyek lehetővé teszik a jelenlegi aerob mikrobiális terhelés fejlesztését, nem igényes.

Tizedes hígítások a CFU-k szokásos agar-számláláshoz való számításához. Forrás: Quentin Geissmann

Mivel a tápközeg nem tartalmaz inhibitorokat, a baktériumok korlátozás nélkül szaporodhatnak, ezáltal ideális az általános kolónia számlálásához. A lemezes mennyiségi meghatározás technikája azonban nem fogja kimutatni az összes jelen lévő baktériumot, hanem csak azokat, amelyek képesek növekedni azokban a környezeti feltételek mellett, amelyeknek a magot tartalmazó standard agarnak kitették.

Ebben az értelemben a lemezes kvantitatív meghatározási technika általában az aerob mezofil típusú baktériumok mennyiségének meghatározására törekszik, azaz azoknak, amelyek 25 és 40 ° C közötti hőmérsékleten, 37 ° C optimális növekedési hőmérsékleten fejlődnek ki..

Ez a baktériumcsoport nagyon fontos, mivel az ember számára kórokozó baktériumok többsége ott található.

Meg kell jegyezni, hogy néha érdekes lehet az élelmiszerekben található pszichofil baktériumok mennyiségének meghatározása. Ezek a baktériumok azok, amelyek alacsony hőmérsékleten (<20 ° C) növekednek, és felelősek azért, hogy az élelmiszerek gyorsabban lebomlanak, még hűtve is.

Hasonlóképpen, a termofil baktériumok, amelyek 50–80 ° C vagy annál nagyobb hőmérsékleten fejlődnek ki, fontosak lehetnek bizonyos élelemtípusokban, például konzervekben.

A mikrobiális mennyiségi meghatározást kolóniaképző egységekben (CFU) fejezzük ki a minta grammjában vagy milliliterében.

bázis

A standard számlálóközeget úgy tervezték, hogy lehetővé tegye a nem igényes aerob baktériumok sikeres szaporodását, mivel az élesztőkivonat, a triptein és a glükóz biztosítják a jó mikrobiális növekedéshez szükséges tápanyagokat.

A táptalaj viszont világos színű és átlátszó megjelenésű, ezért ideális a kolóniák megjelenítéséhez, amelyeket a mély vetési módszerrel fejlesztettek ki (tányér öntés).

A kolóniaszámlálás a Drigalski spatula felszíni vetési módszerrel is lehetséges.

Ha a mikrobiális terhelés magas, a CFU-k kiszámításához a vizsgálati mintát decimálisan kell hígítani.

Meg kell jegyezni, hogy ezt a tápközeget az American Public Health Association (APHA) ajánlja az aerob mezofilek számához.

Készítmény

Mérjünk be 23,5 g dehidratált közeget és oldjuk fel liter desztillált vízben. A teljes feloldódáshoz a keveréket gyakran keverés közben melegíteni kell, amíg felforr. Az ezt követő lépések az alkalmazandó vetési technikától függenek.

A „plate-plate” technikához

Osszuk szét a 12-15 ml-es adagolással a kémcsövekbe. Ezt követően autoklávban, 121 ° C-on, 15 percig sterilizálják. Hagyja függőlegesen megszilárdulni egy tömb alakjában. Használatig tárolandó hűtőszekrényben.

Olvassa el a dugót, amikor használni fogja. Olvadás után tartsa vízfürdőben 44-47 ° C-on, míg a mintákat elkészítik.

Felszíni vetéshez

Sterilizáljuk a tápközeget autoklávban 121 ° C-on, majd 20 ml-t szétterítünk steril Petri-csészékbe. Hagyja megszilárdulni, fordítsa meg és tárolja a hűtőszekrényben felhasználásig.

Használat előtt temperáljuk a lemezeket. A tápközeg pH-jának 7,0 ± 0,2 kell lennie.

Használat

A standard gráf agart az aerob mezofil számlálási technikában használják a víz és az élelmiszer mikrobiológiai elemzése során. Az aerob mezofilek száma szükséges, mivel ez meghatározza a vizsgált minta egészségügyi minőségét.

Ennek a módszernek a felhasználása (ezen táptalaj segítségével) lehetővé teszi az izolált kolóniák makroszkopikus megjelenítését kvantitatív meghatározásuk céljából.

Lemez öntési technika (mély vetés)

-Folyamat

A technika a következőkből áll:

1) Homogenizálja a mintát a jelen lévő baktériumok újraelosztása érdekében.

2) Az első szuszpenziót steril palackban vagy tasakban készítik el, figyelembe véve a 10 g vagy 10 ml minta arányát 90 ml hígítóban (10 ^-1).

3) A kezdeti szuszpenzióból a vonatkozó tizedes hígításokat végzik a minta típusától függően. Pl.: (^10-2, ^10-3, ^10-4). A hígításokat pepton-vízzel vagy foszfát-pufferrel végezzük.

Ehhez vegyen be 1 ml kiindulási szuszpenziót, és tegyen 9 ml hígítószerbe, szükség esetén folytassa a hígítást, most vegyen be 1 ml 10 ^-2 hígítást és így tovább.

4) Vegyen be minden hígításból 1 ml-t, és tegye az üres, Petri-csészékbe.

5) Adjon az egyes lemezekhez 12–15 ml standard számláló agart, amelyet előzőleg megolvasztunk és 44–47 ° C-on ülepítettünk.

6) Finoman forgassa a lemezeket, hogy a mintát az agar mentén egyenletesen eloszlassák és hagyják megszilárdulni.

7) Fordítsuk meg a lemezeket és inkubáljuk 37 ° C-on aerobiosisban 24–48 órán át.

8) Az idő végén a lemezeket megvizsgáljuk, és a telepeket megszámoljuk azt lehetővé tevő hígításban. A megszámlálásra azokat a lemezeket választják, amelyek 30 és 300 CFU között vannak.

A számolás manuálisan is elvégezhető, vagy használhatja a kolóniaszámláló berendezést.

A minta ml-jére megengedett értékek országonként változhatnak, attól függően, hogy milyen szabályokat alkalmaznak.

-A UFC kiszámítása

Az általános számítást az alábbi képlettel végzik:

A CFU mennyiségi meghatározásának általános számítási képlete. Forrás: Országos Gyógyszerügynökség, Élelmiszer- és Orvosi Technológia (ANMAT). Élelmiszer mikrobiológiai elemzése, hivatalos analitikai módszertan, indikátor mikroorganizmusok. 2014. év 3. kötet. Elérhető az anmat.gov.ar oldalon

Az eredményeket 1 vagy 2 számjeggyel fejezzük ki, szorozva a megfelelő 10-el. Példa: ha az eredmény 16,545, akkor a harmadik számjegy alapján 17 000-re kerekíti, és az alábbiak szerint fejezi ki: 1,7 x 10 ⁴. Ha az eredmény 16 436 lenne, kerekítse azt 16 000-re, és fejezzen ki 1,6 x 10 ^4-et.

Felszíni vetési technika

-Folyamat

- Közelebbről 0,1 ml közvetlen mintával, ha folyékony, a kezdeti szuszpenzió 10 ^-1 vagy az egymást követő hígítások 10 ^-2, 10 ^-3 stb. A standard számláló agarlemez közepén.

- A mintát egyenletesen ossza meg Drigalski spatulával vagy L alakú üvegrudakkal, és hagyja 10 percig pihenni.

- Fordítsuk meg a lemezeket és inkubáljuk aerob módon 37 ° C-on 24–48 órán keresztül.

- A telepek megszámlálásához válassza ki azokat a lemezeket, amelyek 20 és 250 CFU közötti tartományban vannak.

-A UFC kiszámítása

A számításhoz a hígítási tényezőt kell alkalmazni, amely inverz. A számot két számjegyre kerekítik (a harmadik szám szerint kerekítve), és a bázis 10 teljesítményében fejezik ki. Például, ha a mintában 224 CFU számolódik hígítás nélkül (10 ^-1), akkor a 22 x 10 ¹ CFU-t kell jelenteni., de ha ez az érték 225 volt, akkor 23 x 10 ¹ CFU-t kell megadni.

Most, ha 199 CFU számítanak a 10 ^-3 hígítás, 20 x 10 ⁴ CFU kell jelenteni, de ha 153 CFU számítanak a fenti hígítási, 15 x 10 ⁴ CFU fog jelenteni.

QA

A standard számú tápközeget ismert tanúsított törzsekkel lehet kiértékelni, mint például: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri.

Ha a tenyésztő táptalaj optimális körülmények között van, minden esetben kielégítő növekedés várható, kivéve az L. fermentum-t, amelynek rendszeres hozama lehet.

A tenyésztő tápközeg sterilitásának értékeléséhez az előkészített tételek egy vagy két lemezt (oltás nélkül) inkubáljuk 37 ° C-on, aerobiosisban, 24 órán át. Ezen idő elteltével a táptalajban nem figyelhető meg növekedés vagy színváltozás.

korlátozások

- Ne olvassa el az agart többször.

-A készített táptalaj akár 3 hónapig is eltarthat, amíg hűtőszekrényben tartják és fénytől védve vannak.

-Ez a táptalaj nem alkalmas igényes vagy anaerob mikroorganizmusokra.

Irodalom

1. Országos Gyógyszerügy, Élelmiszer- és Orvosi Technológia (ANMAT). Élelmiszer mikrobiológiai elemzése, hivatalos analitikai módszertan, indikátor mikroorganizmusok. 2014. év 3. kötet. Elérhető az anmat.gov.ar oldalon
2. Laboratoryios Difco Francisco Soria Melguizo, SA Lemez gróf. 2009.Támogatható:
3. Conda Pronadisa Laboratories. Standard metál agar (PCA), az APHA és az ISO 4833 szerint. Elérhető: condalab.com
4. Britannia Laboratories. Agar lemez szám. 2015.Attól elérhető: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B és Velázquez O. 2009. Az élelmiszerek mikrobiológiai elemzésének technikái. 2nd ed. UNAM Kémiai Kar. Mexikó. Elérhető a következő címen: depa.fquim.unam