DAPI (4 ', 6-DIAMIDINO-2-FENILINDOL): JELLEMZŐK, INDOKLÁS, FELHASZNÁLÁS - KÉMIA - 2025

A DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) fluoreszcens tulajdonságú festékként szolgál markerként, amelyet többek között a fluoreszcens mikroszkópia vagy az áramlási citometria területén széles körben használnak. Az általa kibocsátott fluoreszcencia világoskék, gerjesztése 455-461 nm (UV-fény) között zajlik.

A DAPI festék nagyon könnyedén áthaladhat az elhalt sejtek sejtmembránján. Megfestheti az élő sejtek magjait is, de ebben az esetben ennek a koncentrációnak nagyobbnak kell lennie.

A DAPI fluoreszcens festék kémiai szerkezete. Forrás: Kép: Fájl: A DAPI.svg a fájl vektor verziója. Ezt a raszterkép helyett kell használni, ha nem alacsonyabb szintű / Richard Wheeler (Zephyris) Szerkesztett kép

A festék képes hozzáférni olyan sejt DNS-hez, amelyhez különleges affinitással rendelkezik, nagy lendülettel kötődik az adenin és a timin nitrogénbázisaihoz. Ezért nagyon hasznos bizonyos molekuláris biológiai technikákban.

Ez a vegyület az indolfestékek csoportjába tartozik, és kimutatták, hogy nagyobb érzékenységgel bír a DNS-sel, mint az etidium-bromid és a propidium-jodid, különösen agarózgéleken.

Ennek a fluoreszcens festéknek a használata nagyon széles, mivel hasznos: a DNS-változások tanulmányozására apoptotikus folyamatokban (sejthalál), és ezért a sejtek detektálására ebben a folyamatban; DNS lábnyomok készítéséhez (DNS fénykép nyomtatás); baktériumszennyezés tanulmányozása; vagy a nukleáris szegmentálás megjelenítésére.

A kromoszomális sávok vizsgálatában, a Mycoplasmas sp DNS kimutatásában, a DNS-fehérje kölcsönhatásban, a sejtek immunfluoreszcenciával történő megfestésében és megszámolásában, valamint érett pollenszemcsék színezésére is felhasználták.

jellemzők

A DAPI kémiai név rövidítése (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol). A molekuláris képlete C ₁₆ H ₁₅ N ₅ Ez egy molekulatömege 350,3. Az UV-fénytartomány közelében (345–358 nm) a DAPI-DNS komplex maximális gerjesztése, míg a maximális fluoreszcencia-kibocsátás 455–461 nm között van.

Ezt a festéket sárga porként jellemzik, de az ezzel a fluoroforral megjelölt struktúrák ragyogó kék fényt bocsátanak ki.

Ez egy vízben oldódó vegyület, azonban feloldódásának felgyorsítása érdekében némi hő alkalmazható. Hígítható PBS-sel, de közvetlenül nem oldható fel benne.

A festék elkészítése után sötétben, azaz fénytől védve, 2–8 ° C hőmérsékleten (hűtőszekrényben) kell tárolni. Ilyen körülmények között a festék több mint 3 hétig vagy hónapig stabil.

Ha fénytől védve, de szobahőmérsékleten hagyva, stabilitása 2 vagy 3 hétre csökken, de közvetlen fénynek kitéve a romlás nagyon gyors. Ha sokkal hosszabb ideig kíván tárolni, akkor -20 ° C hőmérsékleten hűthető alikvot részekben.

bázis

Ez a festés egy nukleáris ellenfestés előállításán alapul a fő molekuláris biológiai technikákban, például: áramlási citometria, fluoreszcencia mikroszkópia és többek között a metafázis kromoszómák vagy az interfázisú magok festése.

Ez a technika azon a nagy affinitáson alapszik, amelyet a festék a nitrogén bázisokkal (adenin és ti-amin) tartalmaz a genetikai anyagban (DNS) a kisebb barázdában. Míg a citoplazmatikus szinten nagyon kevés hátteret hagy.

Amikor a fluoreszcens festék a DNS adenin- és timinrégióival kötődik, a fluoreszcencia jelentősen növekszik (20-szor több). A kibocsátott szín élénkkék. Nevezetesen, hogy a GC (guanin-citozin) bázispárokhoz való kötődés során nincs fluoreszcenciakibocsátás.

Fontos megjegyezni, hogy noha az RNS-hez affinitással rendelkezik, ez nem okoz problémát, mivel a molekula legnagyobb energiakibocsátásának mértéke egy másik hullámhosszon (500 nm) fordul elő, ellentétben a DNS-rel, amely 460-as helyzetben ezt teszi meg. nm. Ezenkívül az RNS-hez kötött fluoreszcencia növekedése csak 20%.

A DAPI-t inkább az elhalt (rögzített) sejtek festésére használják, mint az élő sejteket, mivel az utóbbi megfestéséhez sokkal nagyobb a színezék koncentrációja, ennek oka az, hogy a sejtmembrán sokkal kevésbé áteresztő képességgel rendelkezik a DAPI számára, amikor életben van.

A DAPI festék kombinálható vörös és zöld fluoroforral a többszínű élmény érdekében.

Használat

A DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) kiváló fluorofor, ezért széles körben használják különféle technikákban és különféle célokra. Az alábbiakban bemutatjuk a DAPI használatát a fő technikákban.

Áramlási citometria

A Gohde, Schumann és Zante kutatók 1978-ban alkalmazták először a DAPI-t fluorofórként az áramlási citometriás módszerben, és nagy sikert mutattak a nagy DNS-érzékenység és a fluoreszcenciakibocsátás magas intenzitása miatt.

A DAPI használata ebben a technikában lehetővé teszi a sejtciklus tanulmányozását, a sejtek számszerűsítését, valamint az élő és az elhalt sejtek festését.

Noha vannak más színezékek, mint például etidium-bromid, Hoechst-oxid, akridin-narancs és propidium-jodid, a DAPI az egyik legszélesebb körben alkalmazott, mivel fotográfikusabb, mint az előzőekben említettek.

Ehhez a módszerhez a sejteket rögzíteni kell, ehhez abszolút etanolt vagy 4% -os paraformaldehidet lehet használni. A mintát centrifugáljuk és a felülúszót elöntjük, majd a sejteket 5 ml PBS-puffer hozzáadásával 15 percig hidratáljuk.

Amíg az idő telik el, készítse el a DAPI-festést egy festési pufferrel (FOXP3 a BioLegend-től) 3 μM koncentrációban.

Centrifugálja a mintát, dobja ki a felülúszót, majd fedje le 1 ml DAPI oldattal 15 percig szobahőmérsékleten.

Vegyük a mintát az áramlási citométerbe a megfelelő lézerrel.

Áramlásos mikrofluorometria

Egy másik módszer, amelyben a DAPI-t alkalmazzák, áramlásos mikrofluorometriában, egy másik, a mithramicinnek nevezett fluoroforral együtt. Mindkettő hasznos a kloroplaszt DNS külön-külön történő mennyiségi meghatározására, de a DAPI a legjobban a T4 bakteriofág részecskék mérésére.

A hibridizáció

Ez a technika alapvetően olyan fluoreszcens festékkel jelölt DNS-próbákat használ, amelyek DAPI lehetnek.

A mintát hőkezelésre van szükség a kettős szálú DNS denaturálásához és két egyszálú szálgá történő átalakításához. Ezt követően egy DAPI-jelölt denaturált DNS-próbával hibridizálják, amelynek érdekes szekvenciája van.

Később mossuk, hogy eltávolítsuk azt, ami nem hibridizálódott. A DNS megjelenítéséhez kontrasztot alkalmazunk. A fluoreszcens mikroszkóp lehetővé teszi a hibridizált próba megfigyelését.

Ennek a módszernek a célja a kromoszomális DNS-ben lévő specifikus szekvenciák kimutatása, amely lehetővé teszi bizonyos betegségek diagnosztizálását.

Ezek a citomolekuláris technikák nagy segítséget nyújtottak a kariotípusok vizsgálata során a részletek meghatározásában. Például megmutatta az adenozin és a timin bázispárban gazdag régióit, az úgynevezett heterokromatikus régiókat vagy DAPI sávokat.

Ezt a technikát széles körben alkalmazzák növényekben és állatokban a kromoszómák és a kromatin vizsgálatához, valamint az emberek prenatális és hematológiai patológiájának diagnosztizálásához.

Ebben a technikában az ajánlott DAPI koncentráció 150 ng / ml 15 percig.

Az összeállított tárgylemezeket fénytől védve, 2-8 ° C-on kell tárolni.

Immunfluoreszcens festés

A sejteket 4% paraformaldehiddel rögzítjük. Ha más foltokat kell használni, akkor a DAPI-t a végén falfestékként hagyják el, és a sejteket 15 percig fedjük PBS-oldattal. Amíg az idő lejár, készítse el a DAPI oldatot PBS-sel történő hígítás útján úgy, hogy a végső koncentráció 300 μM.

Ezután a felesleges PBS-t eltávolítjuk és 5 percig DAPI-val fedjük le. Többször mosni. A tárgylemezt fluoreszcens mikroszkóp alatt, a megfelelő szűrő alatt nézzük.

Biztonsági adatlap

Ezt a vegyületet körültekintően kell kezelni, mivel mutagén tulajdonságokkal bír. Aktívszénnel e vegyületet eltávolítják a megsemmisítendő vizes oldatokból.

Kesztyűt, köpenyt és védőszemüveget kell használni a reagenssel történő balesetek elkerülése érdekében. Ha bőrrel vagy nyálkahártyával érintkezik, a területet elegendő vízzel kell lemosni.

Soha ne pipettáztassa ezt a reagenst szájon át, használjon pipettát.

Ne szennyezze a reagenst mikrobiális szerekkel, mert ez hibás eredményeket eredményezhet.

Ne hígítsa a DAPI foltot az ajánlottnál nagyobb mértékben, mivel az jelentősen rontja a folt minőségét.

Ne tegye ki a reagenst közvetlen fénynek, vagy tartsa melegen, mert ez csökkenti a fluoreszcenciát.

Irodalom

1. A Brammer S, a Toniazzo C és a Poersch L. Corantes gyakran részt vesz a növényi citogenetikában. Arq. Inst. Biol., 2015, 82. Beszerzés: scielo.
2. Impath Laboratories. DAPI. Elérhető a következő oldalon: menarinidiagnostics.com/
3. Cytocell Laboratories. 2019. Útmutató a DAPI használatához. elérhető a cytocell.com oldalon
4. Elosegi A, Sabater S. Fogalmak és technikák a folyami ökológiában. (2009). Szerkesztői Rubes, Spanyolország. Elérhető a következő címen: books.google.co.ve/
5. Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Fluoreszcencia alkalmazása módosított boncoló módszerrel a myocyták számának becsléséhez a szívszövetben. Melltartó. Cardiol. 2012-ben; 98 (3): 252-258. Kapható a következő címen: scielo
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. A fitoplazmák jelenléte a papayában (Carica papaya) Mexikóban. Chapingo Magazine. Kertészeti sorozat, 2011; 17 (1), 47-50. Elérhető a scielo.org oldalon.