CITOKÉMIA: TÖRTÉNELEM, A TANULMÁNY TÁRGYA, HASZNOSSÁGA ÉS TECHNIKÁK - BIOLÓGIA - 2025

A citokémia olyan technikák sorozatát foglalja magában, amelyek a sejten belüli meghatározott anyagok azonosítására és elhelyezkedésére támaszkodnak. A sejtbiológia egyik ágának tekintik a sejt morfológiáját a kémiai szerkezettel.

Bensley, a modern citológia alkalmazásának alapítója szerint kijelenti, hogy a citokémia célja a sejtek kémiai szervezetének felfedezése az élet rejtélyeinek megértése érdekében. A különböző funkcionális szakaszokban bekövetkező dinamikus változások tanulmányozása mellett.

1: Paget extramammary betegsége. (Hematoxilin-Eozin) 2: seniil plakkok, amelyeket az agykéregben megfigyelték Alzheimer-kóros betegekben. (Ezüst impregnálás) 3: Nyúl nyelv, Kollagén szálak (kék). Izomrostok (lila csíkok). (Masson trikrómja). 4: Májszövet zsíros degenerációval. (Szudán III) 5: Gyulladt máj. Elhalás. (Toluidin-kék) Források: Wikipedia. com / Felhasználó: KGH / Public Domain fájlok / Mohit Lalwani

Ilyen módon meg lehet határozni ezen anyagok metabolikus szerepét a sejtben.

A citokémia két fő módszert használ. Az első kémiai és fizikai eljárásokon alapul. Ezek a technikák arra szolgálnak, hogy a mikroszkópot elengedhetetlenül szükséges eszközként használják a sejten belüli meghatározott anyagokon zajló kémiai reakciók megjelenítéséhez.

Példa: citokémiai festékek, például a Feulgen-reakció vagy a PAS-reakció használata.

A második módszer biokémián és mikrokémián alapul. Ezzel a módszerrel kvantitatív módon meg lehet határozni az intracelluláris vegyi anyagok jelenlétét.

A szövet- vagy sejtszerkezetben felfedhető anyagok a következők: fehérjék, nukleinsavak, poliszacharidok és lipidek.

A citokémia története

A citokémiai technikák a találmányunk feltalálása óta segítették megérteni a sejtek összetételét, és az idő múlásával számos olyan technika kifejlődött, amelyek különféle típusú, eltérő affinitással és alapvetőségű festékeket használnak.

Ezt követően a citokémia új horizontot nyitott bizonyos szubsztrátumok felhasználásával, hogy kolorimetrikusan megmutatják enzimek vagy más molekulák jelenlétét a sejtben.

Hasonlóképpen, más technikák is megjelentek, például immunocitokémia, amely nagy segítséget nyújtott sok betegség diagnosztizálásában. Az immuncitokémia az antigén-antitest reakciókon alapul.

Másrészről, a citokémia fluoreszkáló anyagokat is használt fluorokrómoknak, amelyek kiváló markerek bizonyos sejtszerkezetek kimutatására. A fluorokróm tulajdonságai miatt kiemeli azokat a szerkezeteket, amelyekhez rögzítették.

Mit tanulsz?

A biológiai mintán alkalmazott különféle citokémiai technikáknak van valami közös: felfedik egy adott típusú anyag jelenlétét, és tudják annak helyét az értékelni kívánt biológiai szerkezetben, legyen az sejt vagy szövet.

Ezek az anyagok lehetnek enzimek, nehézfémek, lipidek, glikogén és meghatározott kémiai csoportok (aldehidek, tirozin stb.).

Az ezekkel a technikákkal nyújtott információk nemcsak a sejtek azonosításához, hanem a különféle patológiák diagnosztizálásához is útmutatást nyújthatnak.

Például a citokémiai foltok nagyon hasznosak a különféle típusú leukémiák megkülönböztetésében, mivel egyes sejtek bizonyos enzimeket vagy kulcsfontosságú anyagokat expresszálnak, mások nem.

Másrészt meg kell jegyezni, hogy a citokémia használata lehetséges, a következő szempontokat kell figyelembe venni:

1) Az anyagot immobilizálni kell abban a helyen, ahol természetesen megtalálható.

2) Az anyagot olyan szubsztrátumok segítségével kell azonosítani, amelyek kifejezetten vele reagálnak, és nem más vegyületekkel.

Hasznosság

A minták, amelyek citokémiai technikákkal vizsgálhatók, a következők:

- Meghosszabbított perifériás vér.

- Meghosszabbított csontvelő.

- A szövetek hisztokémiai technikákhoz rögzítve.

- Sejtek citocentrifugálással rögzítve.

A citokémiai technikák nagymértékben támogatják a hematológiát, mivel széles körben alkalmazzák bizonyos típusú leukémiák diagnosztizálásában és megkülönböztetésében.

Például: Az öszteráz reakciókat megkülönböztetik a mielo-monocitikus leukémiát az akut monocitikus leukémiától.

Ezeknek a betegeknek a csontvelője és a perifériás vérkenet hasonlóak, mivel egyes sejteket nehéz morfológiai szempontból önmagában azonosítani. Ehhez elvégezzük az észteráz-tesztet.

Az elsőben a specifikus észterázok pozitívak, míg a másodikban a nem specifikus észterázok pozitívak.

Ezek a szövettani vizsgálatokban is nagyon hasznosak, mivel például a nehézfémekkel végzett festési eljárás (ezüst impregnálás) megfesti az intenzív barna színű retikuláris szálakat a szívizomszövetben.

A citokémia technikái

A leggyakrabban használt technikákat az alábbiakban ismertetjük:

- Színezékek használata

A felhasznált foltok a citokémiai technikákban nagyon változatosak, és ezeket több szempont szerint lehet osztályozni:

A radikális adatok szerint, amelyekkel rokonságuk van

Ezek fel vannak osztva: savas, lúgos vagy semleges. Ezek a legegyszerűbbek és a legelterjedtebbek a történelem során, lehetővé téve a megkülönböztetést a bazofil komponensektől az acidofil komponensektől. Példa: hematoxilin-eozin-festés.

Ebben az esetben a sejtek magjai kékké válnak (hematoxilint vesznek fel, amely az alapfestés), és a citoplazmák piros színűek (eozint vesznek fel, amely a savfolt).

Az általuk biztosított szín szerint

Lehetnek ortokromatikus vagy metakromatikusak. Az ortokromatikumok azok a színek, amelyek ugyanolyan színűek, mint a festék. Például az eozin esete, amelynek vörös színű és piros színű.

Másrészt a metakromatikumok a színektől eltérő színű struktúrát mutatnak, mint például a toluidin, amelynek a színe kék és mégis ibolya.

Vital vagy supravital festékek

Ártalmatlan színezékek, azaz színezik a sejteket és életben maradnak. Ezeket a foltokat létfontosságúnak (pl. Tripánkékből festeni a makrofágokhoz) vagy supravitalnak (pl. Janus green, hogy megfestik a mitokondriumokat, vagy semleges vörösnek, hogy foltot lizoszómáknak) neveznek.

- A lipidek kimutatása zsírban oldódó színezékekkel

Ozmium-tetroxid

Feketével festi a lipideket (telítetlen zsírsavak). Ez a reakció megfigyelhető a fénymikroszkóppal, de mivel ez a festék nagy sűrűségű, elektronmikroszkóppal is megjeleníthető.

Szudán III

Ez az egyik leggyakrabban használt. Ez a festék diffundál és oldódik a szövetekben, felhalmozódva a lipidcseppek belsejében. A szín skarlátvörös.

Szudán fekete folt B

Jobb kontrasztot ad, mint az előzőek, mivel képes feloldódni a foszfolipidekben és a koleszterinben is. Hasznos érett granulociták és azok prekurzorai azurofil és specifikus granulátumának kimutatására. Ezért azonosítja a mieloid leukémiákat.

- Aldehidcsoportos festés (perifériás savas Schiff-folt)

Periódusos sav-Schiff-festés háromféle aldehidcsoportot képes kimutatni. Ők:

- Szabad aldehidek, amelyek természetesen jelen vannak a szövetekben (plazma reakció).

- Szelektív oxidációval (PAS-reakció) előállított aldehidek.

- Szelektív hidrolízissel (Feulgen-reakció) előállított aldehidek.

PAS reakció

Ez a festés bizonyos típusú szénhidrátok, például glikogén kimutatására épül. Az időszakos sav Schiff megbontja a szénhidrátok CC-kötéseit az 1-2 glikolcsoportok oxidációja következtében, lehetővé téve az aldehidcsoportok felszabadulását.

A szabad aldehidcsoportok reagálnak a Schiff-reagenssel és lila-vörös vegyületet képeznek. A lila-piros szín megjelenése pozitív reakciót mutat.

Ez a teszt pozitív a növényi sejtekben, és keményítőt, cellulózt, hemicellulózt és peptideket detektál. Míg az állati sejtekben mucineket, mucoproteineket, hialuronsavat és kitint észlel.

Ezenkívül hasznos a lymphoblasztikus leukémia vagy erythroleukemia diagnosztizálásában, a mielodiszplasztikus típusú egyéb patológiák között.

Savas szénhidrátok esetén az alcian kék folt használható. A teszt pozitív, ha világoskék / türkiz színű megfigyelést mutatnak.

Plazma reakció

A plazma reakció bizonyos hosszú láncú alifás aldehidek, például pálma és sztearál jelenlétét deríti ki. Ezt a technikát fagyasztott szövettani metszetekre alkalmazzák. Közvetlenül a Schiff-reagenssel kezeljük.

Feulgen reakció

Ez a módszer kimutatja a DNS jelenlétét. A módszer abból áll, hogy a rögzített szövetet gyengén savas hidrolízisnek vetik alá, hogy később reagáljon a Schiff-reagenssel.

A hidrolízis a dezoxiribóz-aldehid-csoportokat teszi ki a dezoxiribóz-purin kötésnél. A Schiff-reagens ezután reagál az aldehidcsoportokkal, amelyek szabadon maradtak.

Ez a reakció pozitív a sejtmagokban és negatív a sejtek citoplazmáiban. A pozitivitást egy piros szín jelenléte bizonyítja.

Ha ezt a módszert metil-zöld-pironinnal kombináljuk, akkor lehetséges a DNS és az RNS egyidejű detektálása.

- Citokémiai foltok a fehérjeszerkezetekhez

Ehhez felhasználható a Millon-reakció, amely reagensként higany-nitrátot használ. Az aromás aminosavakat tartalmazó struktúrák pirossá válnak.

- Citokémiai foltok, amelyek szubsztrátokat használnak enzimek jelenlétének kimutatására

Ezek a foltok a biológiai mintának egy adott szubsztráttal történő inkubálásán alapulnak, és a reakciótermék ezt követően diazo-sókkal reagál, hogy színes komplexet képezzen.

észterázok

Ezek az enzimek vannak jelen egyes vérsejtek lizoszómáiban és képesek hidrolizálni a naftolt felszabadító szerves észtereket. Ez utóbbi oldhatatlan azo-színezéket képez, amikor egy diazo-sóhoz kötődik, és megfesti a reakció helyét.

Számos szubsztrát létezik, és attól függően, hogy melyiket használják, specifikus észterázok és nem specifikus észterázok azonosíthatók. Az előbbiek a mieloid sorozat éretlen sejtjeiben vannak, utóbbiak monocitikus eredetű sejtekben vannak jelen.

A specifikus észterázok meghatározására használt szubsztrát: naftool-AS-D-klór-acetát. Míg a nem-specifikus észterázok meghatározására számos szubsztrát alkalmazható, például naftol AS-D-acetát, alfa-naftil-acetát és alfa-naftil-butirát.

Mindkét esetben a sejtek mélyvörösre festenek, ha a reakció pozitív.

myeloperoxidase

Ez az enzim megtalálható a granulocitikus sejtek és monociták azurofil granulátumában.

A detektálás során megkülönböztetik a mieloid eredetű leukémiákat a limfoidoktól. A mieloperoxidázokat tartalmazó sejtek okker sárgássá válnak.

foszfatázok

Ezek az enzimek felszabadítják a foszforsavat a különféle szubsztrátumokból. Ezek különböznek egymástól a szubsztrát specifitása, a pH és az inhibitorok és inaktivátorok hatása alapján.

A legismertebbek azok a foszfono-észterázok, amelyek az egyszerű észtereket (PO) hidrolizálják. Példa: lúgos foszfatáz és savas foszfatáz, valamint foszfamidázok, amelyek a kötéseket hidrolizálják (PN). Ezeket a limfoproliferatív szindrómák megkülönböztetésére és a szőrös sejtes leukémia diagnosztizálására használják.

- Trikróm színek

Mallary-Azan trichrom

Hasznosak a sejtek citoplazmájának megkülönböztetésére a kötőszövet szálaitól. A sejtek piros színűek és a kollagénszálak kék színűek.

Masson trikrómja

Ennek ugyanaz a hasznossága, mint az előzőnél, de ebben az esetben a sejtek piros színűek és a kollagén rostok zöldek.

- Festékek, amelyek meghatározott organellákat festenek

Janus Green

Szelektív módon megfesti a mitokondriumokat.

Ezüst sók és ozmikus sav

Megfesti a Golgi készüléket.

Toluidin-kék

Festi Nissi testeit

Ezüstsók és PAS

Festék a retikáris szálakat és az alapréteget.

Orcein és fukszin rezorcin

Elasztikus szálakat festenek. Az elsõkkel barna színû, a második mélykék vagy lila színûek.

- Más módszerek, amelyeket a citokémában használnak

Fluoreszkáló anyagok vagy fluorkrómok használata

Vannak olyan technikák, amelyek fluoreszkáló anyagokat használnak a sejtekben levő struktúrák vizsgálatára. Ezeket a reakciókat egy speciális mikroszkóppal, fluoreszcenciának nevezzük. Példa: IFI technika (közvetett immunfluoreszcencia).

Sejtes komponensek kimutatása immuncitokémia segítségével

Ezek a technikák nagyon hasznosak az orvostudományban, mivel elősegítik egy bizonyos sejtszerkezet felismerését és számszerűsítését is. Ez a reakció egy antigén-antitest reakción alapul. Például: ELISA technikák (Enzyme Immuno Assay).

ajánlások

- A színezékek jó teljesítményének értékeléséhez kontroll kenőanyagokat kell használni.

- Friss keneteket kell használni citokémiai festésnek. Ha ez nem lehetséges, akkor fénytől védve és 4 ° C-on kell tárolni.

- Ügyelni kell arra, hogy a használt rögzítőszer ne befolyásolja negatívan a vizsgált anyagot. Más szavakkal: meg kell akadályozni, hogy kinyerje vagy gátolja.

- A rögzítőszerek használatának idejét tiszteletben kell tartani, mivel általában csak másodpercekig tarthat, mivel a kenet hosszabb ideig tartó kitettsége a rögzítőszerre bizonyos enzimeket károsíthat.

Irodalom

1. „Sejtkémiai.” Wikipédia, a szabad enciklopédia. 2018. június 30., 17:34 UTC. 2019. július 9., 02:53 Elérhető itt: wikipedia.org
2. Villarroel P, de Suárez C. Fémes impregnálási módszerek a miokardiális retikuláris rostok vizsgálatához: összehasonlító vizsgálat. RFM 2002; 25 (2): 224-230. Elérhető a scielo.org oldalon
3. Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T. Savas foszfatáz citokémia: módszertani megfontolások. Rev Diagn Biol., 200; 50 (2): 89-92. Elérhető a scielo.org oldalon
4. De Robertis E, De Robertis M. (1986). Sejtes és molekuláris biológia. 11. kiadás. Szerkesztői Ateneo. Buenos Aires, Argentína.
5. Klasszikus eszközök a sejtbiológia tanulmányozásához. TP 1 (kiegészítő anyag) - sejtbiológia. Elérhető a következő címen: dbbe.fcen.uba.ar