ENDONUKLEÁZOK: FUNKCIÓK, TÍPUSOK ÉS PÉLDÁK - BIOLÓGIA - 2024

Az endonukleázok olyan enzimek, amelyek levágják a nukleotid láncban található foszfodiészter kötéseket. Az endonukleáz restrikciós helyek nagyon változatosak. Ezen enzimek egy része szinte bárhol elvágja a DNS-t (dezoxiribonukleinsav, genetikai anyagunk), vagyis nem specifikus.

Ezzel szemben létezik egy másik endonukleáz csoport, amely nagyon specifikus a hasítandó régióban vagy szekvenciában. Az enzimek ezen csoportját restrikciós enzimeknek nevezik, és nagyon hasznosak a molekuláris biológiában. Ebben a csoportban a jól ismert Bam HI, Eco RI és Alu I enzimek vannak.

Az endonukleázok belsőleg vágják a DNS-t.

Forrás: pixabay.com

Az endonukleázokkal ellentétben léteznek egy másik típusú katalitikus fehérje - exonukleázok -, amelyek felelősek a foszfodiészter kötések megszakításáért a lánc végén.

Restrikciós endonukleázok

A restrikciós endonukleázok vagy restrikciós enzimek olyan katalitikus fehérjék, amelyek felelősek a foszfodiészter kötéseknek a DNS-láncon belüli hasításáért nagyon specifikus szekvenciákban.

Ezek az enzimek beszerezhetők több biotechnológiai társaságtól, és felhasználásuk szinte nélkülözhetetlen a jelenlegi DNS-manipulációs technikákban.

A restrikciós endonukleázok elnevezése annak a szervezetnek a binomiális tudományos nevének első betűivel történik, ahonnan származnak, majd a törzs követi (ez nem kötelező) és azzal a restrikciós enzim csoporttal végződik, amelyhez tartoznak. Például a BamHI és az EcoRI széles körben alkalmazott endonukleázok.

A DNS régiót, amelyet az enzim felismer, restrikciós helynek nevezzük, és egyedi az egyes endonukleázokkal, bár több enzim egybeeshet a restrikciós helyeken. Ez a hely általában egy rövid, körülbelül 4-6 bázispár hosszú palindrom szekvenciából áll, mint például az AGCT (Alu I esetében) és a GAATTC az Eco RI esetében.

A palindróm szekvenciák olyan szekvenciák, amelyek bár az 5 '- 3' vagy 3 '- 5' irányban olvashatók, azonosak. Például, EcoRI esetén a palindrom szekvencia: GAATTC és CTTAAG.

A restrikciós endonuklek funkciói és alkalmazásai

A molekuláris biológusok szerencséjére a baktériumok az evolúció során számos restrikciós endonukleáz sorozatot fejlesztettek ki, amelyek belsőleg a genetikai anyagot fragmentálják.

A természetben ezek az enzimek - feltehetően - baktériumvédő rendszerként fejlődtek ki idegen DNS-molekulák, például a fágokból származó invázió ellen.

Annak érdekében, hogy megkülönböztessük a natív és az idegen genetikai anyagot, ezek a restrikciós endonukleázok képesek felismerni a specifikus nukleotid szekvenciákat. Így a DNS-t, amely nem rendelkezik ezzel a szekvenciával, zavarhatja a baktériumok belseje.

Ezzel szemben, amikor az endonukleáz felismeri a restrikciós helyet, akkor megkötődik a DNS-hez és elvágja azt.

A biológusok érdekli az élőlények genetikai anyagának tanulmányozása. A DNS azonban több millió bázispárból áll. Ezek a molekulák rendkívül hosszúak, és kis részekben elemezni kell őket.

E cél elérése érdekében a restrikciós endonukleázokat különféle molekuláris biológiai protokollokba integrálják. Például egy egyedi gént elfoghatunk és replikálhatjuk a jövőbeni elemzéshez. Ezt a folyamatot gén klónozására hívják.

Restrikciós fragmens hosszúságú polimorfizmus (RFLP)

A restrikciós fragmens hosszúságú polimorfizmusok a DNS specifikus nukleotidszekvenciáinak mintázatára utalnak, amelyeket a restrikciós endonukleázok képesek felismerni és kivágni.

Az enzimek sajátosságainak köszönhetően mindegyik organizmust egy specifikus vágási mintázat jellemzi a DNS-ben, változó hosszúságú fragmensek származnak.

A restrikciós endonukleázok típusai

A restrikciós endonukleázokat történelmileg három típusú enzimbe sorolták be, amelyeket római számok jelöltek. Nemrégiben leírták az endonukleáz negyedik típusát.

I. típusú

Az I. típusú endonukleázok legfontosabb tulajdonsága, hogy több alegységből álló fehérjék. Ezek mindegyike egyetlen protein komplexként funkcionál, és általában két alegységgel rendelkezik, az úgynevezett R, kettő M és egy S.

Az S rész felelős a restrikciós hely felismerésében a DNS-ben. Az R alegység a hasítás szempontjából elengedhetetlen és M a metilezési reakció katalizálásáért felel.

Az I. típusú enzimek négy alkategóriája létezik, amelyeket A, B, C és D betűkkel ismerünk. Ez az osztályozás a genetikai komplementáción alapul.

Az I. típusú enzimek voltak az első restrikciós endonukleázok, amelyeket felfedeztek és tisztítottak. A molekuláris biológiában azonban a leghasznosabb a II. Típusú, amelyet a következő szakasz ismertet.

II

A II. Típusú restrikciós endonukleázok felismerik a specifikus DNS-szekvenciákat és a hasadást állandó helyzetben, egy olyan szekvencia közelében, amely 5 'foszfátokat és 3' hidroxilcsoportokat állít elő. Általában magnézium-ionokra (Mg ²⁺) van szükség, mint kofaktorok, de vannak olyanok, amelyeknek sokkal specifikusabb követelményeik vannak.

Szerkezetileg monomerekként, dimerként vagy akár tetramerként is megjelenhetnek. A rekombináns technológia II. Típusú endonukleázokat alkalmaz, ezért több mint 3500 enzimet jellemeztek.

III

Ezek az enzimatikus rendszerek két génből állnak, úgynevezett mod és res, amelyek a DNS-t felismerő alegységeket, valamint a módosításokat vagy korlátozásokat kódolják. Mindkét alegységre szükség van a restrikcióhoz, amely eljárás teljesen függ az ATP hidrolízisétől.

A DNS-molekula hasítása érdekében az enzimnek kölcsönhatásba kell lépnie a nem palindrom felismerési szekvencia két példányával, és a helyeknek fordított irányban kell lenniük a szubsztráton. A hasítást egy DNS-transzlokáció előzi meg.

IV

Egy újabb csoportot azonosítottak a közelmúltban. A rendszer két vagy több gént tartalmaz, amelyek olyan fehérjéket kódolnak, amelyek csak módosított DNS-szekvenciákat hasítanak, akár metilezett, hidroxi-metilezett vagy hidrometilált glükozilcsoportot.

Például az EckKMcrBC enzim felismer két RinC általános formájú dinukleotidot; egy purint, majd egy metilezett citozint, amelyet több bázispárral lehet elválasztani - 40 és 3000 között. A hasítás körülbelül 30 bázispárra megy végbe az enzim által felismert hely után.

V típusú endonukleázok

Az ilyen típusú endonukleázok "homing" endonukleázokként is ismertek. Ezek az enzimek felismerik és kivágják a cél-DNS-szekvenciát a genom egyedi helyein, 14–40 bázispárra.

Ezeket az enzimeket gyakran intronok kódolják, és úgy gondolják, hogy funkciójuk elősegíti a vágott szekvenciák vízszintes átvitelét. A vágás után a komplementer szekvencia alapján törésjavítás történik a DNS kettős spirálban.

Példák

Az E. coliból származó endonukleáz I védőrendszerként működik a fágok és az élősködők ellen. Elsősorban a citoplazmatikus membrán és a sejtfal között helyezkedik el. Kettős szálú töréseket okoz az idegen DNS-ben, amellyel kölcsönhatásba lép a periplazma térben.

A CRISPR-Cas endonukleázok olyan enzimek, amelyek számos baktériumtípus védekező mechanizmusát befolyásolják. Ezek azonosítják és kivágják a betolakodó szervezetek specifikus DNS-szekvenciáit, amelyek általában vírusok.

Nemrégiben a Massachusetts Institute of Technology (MIT) kutatói felfedezték a CRISPR-Cas12bm genomszerkesztő rendszert nagy pontossággal az emberi sejtek módosítására.

Irodalom

1. Burrell, MM (szerk.). (1993). A molekuláris biológia enzimei. Totowa, NJ: Humana Press.
2. Loenen, WA, Dryden, DT, Raleigh, EA és Wilson, GG (2013). I. típusú restrikciós enzimek és rokonok. Nukleinsavak kutatása, 42 (1), 20-44.
3. Murray, PR, Rosenthal, KS és Pfaller, MA (2017). Orvosi mikrobiológia + StudentConsult spanyolul + StudentConsult. Elsevier Health Sciences.
4. Nathans, D. és Smith, HO (1975). Restrikciós endonukleázok a DNS-molekulák elemzésében és átalakításában. A biokémia éves áttekintése, 44 (1), 273-293.
5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., és Wende, W. (2005). II. Típusú restrikciós endonukleázok: szerkezet és mechanizmus. Sejtes és molekuláris élettudományok, 62 (6), 685.