K PROTEINÁZ: JELLEMZŐK, ENZIMATIKUS AKTIVITÁS, ALKALMAZÁSOK - BIOLÓGIA - 2025

A K proteináz egy enzim, amely a szerin proteázok csoportjába tartozik, azaz közepén katalitikusan aktív szerin aminosav van, és hidrolízissel megbontja a peptidkötéseket. Ez az enzim viszont a szubtilizin fehérjék (peptidáz S8) családjába tartozik.

A proteináz K molekulatömege (MW) 28 900 dalton, és 1974-ben került először először az Engyodontium gomba gomba kivonataiban, amelyet korábban Tritirachium album Limber néven ismertek.

A proteináz molekuláris szerkezete Forrás: Lykchiniadis

Magas proteolitikus képességgel rendelkezik, ezt bizonyítja, hogy képes lebontani a hajban lévő keratint. A keratin szót angolul "keratin" -nek nevezik, ezért "proteináz K" -nek hívták.

Mivel a natív proteinek hasító képessége nagy, ez az enzim felhasználható különféle molekuláris biológiai technikákban. Elsősorban a nagy molekulatömegű (MW) nukleinsavak izolálására és előállítására használják.

A proteináz K úgy működik, hogy felszabadítja a nukleáris DNS-t, miközben elpusztítja a fehérjéket és inaktiválja az RNázokat és a DNázokat, vagyis kiküszöböli a nukleázokat a DNS és RNS készítményekben.

Másrészt azt látták, hogy a proteináz K képes hidrolizálni néhány denaturált natív fehérjét, ami felhívta a kutatók érdeklődését a prionfehérjék (PrPC) tanulmányozására való felhasználásukra.

Magas proteolitikus hatékonyságuk ellenére vannak olyan fehérjék, amelyek rezisztensek a proteináz K hatására. Ezek között vannak olyan rendellenes fehérjék, amelyeket prionoknak (PrPSc) hívnak, és amelyek transzmissziós szivacsos agyvelőbántalmakkal társulnak.

A proteináz K tulajdonságai

A K proteinkáz tercier felépítése három rétegből áll, és hét láncú β lap van elhelyezve két helikaréteg között. Mivel az S8 peptidázok családjába tartozik, azt jellemzi, hogy aktív helyén katalitikus triád van, amelynek sorrendje (Asp, His és Ser), amely megkülönbözteti őket a peptidázok többi családjától.

Ezt a szerinproteázok csoportjából származó enzimet az jellemzi, hogy a peptidkötéseket az alifás és aromás aminosavak karboxilcsoportjának közelében hidrolizáljuk.

Másrészt képes bizonyos maró hatású anyagok jelenlétére, például nátrium-dodecil-szulfát (SDS), Tris-HCL és EDTA jelenlétére, amelyek segítenek a fehérjék denaturációjában, és elveszítik natív szerkezetüket.

Ez egy előzetes lépés a fehérjék előállításához az elektroforézis technikához. A proteináz K működésének pH-tartománya meglehetősen széles (2,0–12,0), optimális pH-ja 7,5–12,0, izoelektromos pontja pedig 8,9. Mint látható, nagyon széles pH-tartományban aktív.

Egy másik jellemző, amely kiemelkedik a proteináz K-ban, a stabilitása magas hőmérsékletek (50 - 60 ° C) jelenlétében.

Enzimatikus tevékenység

A proteináz K megköveteli a kalcium-ion jelenlétét, bár ez nem befolyásolja annak aktivitását, ha ez stabilitásának fenntartása nélkülözhetetlen.

Ahhoz, hogy a proteináz K teljes mértékben emészthesse a szubsztrátot, körülbelül 5 perc és 2 óra közötti érintkezési idő szükséges.

Ebben az értelemben azonban Daza és munkatársai összehasonlították a kapott protein tisztaságát a proteináz K különböző expozíciója során, és arra a következtetésre jutottak, hogy a hosszabb (24 óráig tartó) inkubálás jelentősen javítja a DNS minőségét.

A különféle protokollokban alkalmazott proteináz K enzim koncentrációjával kapcsolatban azonban azt mondhatjuk, hogy nagyon változatos.

Nagyon alacsony koncentrációktól (5 µg / ml) 500 µg / ml koncentrációig alkalmazható. De a leggyakoribb munkakoncentrációk 50–100 μg / ml között vannak, különösen a protein emésztéssel és a nukleáz inaktiválással kapcsolatban. Noha a szövetek kezelésére 2 mg / ml koncentráció szükséges.

Alkalmazások

Alkalmazása nagyon széles, és az alábbiak szerint foglalható össze:

- A fehérjék emésztésében és a DNS extrakcióban különféle módszerekkel alkalmazhatók, például: sózás, PK-SDS, cetil-trimetil-ammónium-bromid (CTAB), módosított kálium-acetát és nátrium-jodiddal történő extrahálás.

-A nukleázok (RNázok és DNázok) inaktiválása.

- Az in situ hibridizációs technikában (HIS) a nem kívánt fehérjék kiküszöbölése mellett a nukleinsav felszabadulásának elősegítésére.

-A fehérjék módosítása.

-Kutatási szinten, különféle tanulmányokban.

A proteináz K előnyei

Számos összehasonlító vizsgálatot végeztek a proteinkáz K-t használó DNS-extrakciós technikák között, másokkal, amelyek nem használják, és mindegyik megállapítja, hogy az enzim használata nagyobb előnyökkel jár. Az előnyei a következők:

- Nagy molekulatömegű, jó minőségű és tisztaságú DNS-t kapunk.

- Az extrahált DNS legfeljebb 3 hónapig stabil.

Az extrahált DNS felhasználható a következő technikákban: Southern blot, polimeráz láncreakció (PCR), elektroforézis, többek között.

Proteináz K-rezisztens fehérjék

Különböző vizsgálatok arra a következtetésre jutottak, hogy a prionok (abnormális toxikus PrPSc fehérjék) abban különböznek a PrPC (natív) fehérjéktől, hogy rezisztensek a proteináz K hatására, míg a PrPC-k érzékenyek annak hatására.

Más szerzők leírták, hogy a PrPSc szerkezetében érzékeny részek vannak, míg más részek rezisztensek a proteináz K-ra. Ugyanakkor mindkét rész ugyanolyan toxikus és fertőző.

Másrészt, Bastian és munkatársai 1987-ben 4, 28, 30, 66 és 76 kda-os fehérjét izoláltak a Spiroplasma mirum fajból. Mindegyiket rezisztensnek találták a proteináz K hatására, és keresztpróbával is reagáltak egyes prionokkal.

Ismert, hogy ez a faj szürkehályogot és jelentős neurológiai károsodásokat okozhat, és Bastian tudományos eredményei alapján - többek között a kutatások között - megkíséreltek összekapcsolni ezt a mikroorganizmust az átvihető szivacsos agyvelőbántalmakkal.

Ennek a degeneratív idegrendszeri patológiának a etiológiáját ma továbbra is a prionok tulajdonítják.

Ebben az értelemben Butler és munkatársai 1991-ben azonosították és jellemezték a Mycoplasma hyorhinis két törzséből a 40 kda proteináz K-rezisztens osztályt. Ez a kórokozó a sertéseket érinti, megfertőzve szöveteiket, de ebben az esetben nem történt keresztreakció a vizsgált prionokkal.

További kutatásokra van szükség sok ismeretlen felderítéséhez ebben a tekintetben.

Irodalom

1. Bastian F, Jennings R és Gardner W. 1987. A scrapie -hoz kapcsolódó fibrinproteinek antiszéruma keresztreakcióba lép a Spiroplasma miru m fibrill proteinekkel. J. Clin. Microbiol. 25, 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. Egy DNS-extrakciós és tisztítási módszer értékelése az azonosítatlan üregek formaldehid-fixált izomszövetéből. Med Magazine, 2014; 22 (1): 42–49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E, és Mcgarrity G. A proteináz K-rezisztens fehérjék azonosítása és jellemzése a Mollicutes osztály tagjai között. Infection and Immunity, 59 (3), 1037-1042 (1991)
4. López M., Rivera M., Viettri M, Lares M., Morocoima A, Herrera L, et al. Két axenikus közegben termelt Trypanosoma cruzi DNS extrakciós protokoll összehasonlítása. Peru tisztelete. Med. Exp. Közegészségügy 2014; 31 (2): 222-227. Elérhető a scielo.org oldalon
5. Jiménez G, Villalobos M., Jiménez E és Palma W. Öt DNS extrakciós protokoll hatékonyságának meghatározása paraffinizált anyagból molekuláris vizsgálatokhoz. Rev Méd Univ Costa Rica. 2007-ben; 1 (1): 10-19.