DNS-SZEKVENÁLÁS: MAXAM-GILBERT, MÓDSZER ÉS PÉLDÁK - BIOLÓGIA - 2026

A DNS-szekvenálás (dezoxiribonukleinsav) egy eljárás a molekuláris biológiai laboratóriumokban, amely lehetővé teszi a nukleotidok sorrendjének megismerését az érdekes genetikai anyagban. Ezenkívül az RNS (ribonukleinsav) szekvenálását is felfedhetjük.

Ez a technika nélkülözhetetlen a biológiai tudományok fejlődéséhez. Alkalmazható más tudásterületekre is - például az orvosi diagnózisra és a kriminalisztikai vizsgálatokra.

Forrás: pixabay.com

Korábban egy DNS-szál szekvenálását lassú és drága tevékenységnek tekintették, amely csak néhány bázispár azonosítását tette lehetővé az oligonukleotidokban.

Manapság, a tudomány minden előrelépésével, a DNS szekvenálás rutinszerű műveletnek számít sok laboratóriumban világszerte, köszönhetően a közel 50 éves kutatásnak ezen a területen. A lánchossz szempontjából akár millió bázispárt lehet szekvenálni nagyon rövid idő alatt.

Ehhez tucatnyi technikát fejlesztettek ki, amelyek áron és pontosságon változnak. Ebben a cikkben mind a klasszikus, mind a modern technikákat leírjuk, mindegyik előnyeivel és hátrányaival együtt.

Eddig a szekvenálási technikák lehetővé tették a teljes genomok szekvenciájának megszerzését, a kis prokariótáktól és az élesztőktől a humán genomig.

DNS-szerkezet

A DNS-szekvenáláshoz használt módszerek és technikák megértéséhez meg kell ismerni a molekula szerkezetének és összetételének bizonyos kulcsfontosságú aspektusait.

A DNS egy biomolekula, amely minden élőlényben megtalálható, baktériumoktól kezdve a nagy víziállatokig. A organellák - például a mitokondriumok és a kloroplasztok - kör alakú DNS-molekulát tartalmaznak. Még néhány vírus esetében is a genetikai anyag a DNS.

Szerkezetileg a DNS nukleotidok gyűjteménye. Mindegyik szénhidrátból, nitrogénbázisból (A, T, C vagy G) és foszfátcsoportból áll. A DNS-szekvenálás célja annak feltárása, hogy a négy nitrogénbázis milyen sorrendben található meg a szekvenciában.

Történelem

Az 1950-es évek közepén Watson és Crick kutatók krisztalográfiai technikákkal írták le a DNS szerkezetét. Ezeknek a kutatóknak azonban egyik sem tudta megtalálni a szekvencia kibontásának módját.

Annak ellenére, hogy volt néhány előd, a legfontosabb esemény a Sanger-módszer létrehozása volt, 1977-ben. Frederick Sanger, a módszer apja, egy brit biokémikus volt, aki két Nobel-díjat nyert a biológiai tudományok iránti óriási hozzájárulása miatt.

Ezt a technikát az irodalomban "lánc terminációnak" vagy dideoxinukleotidnak is nevezik. Az alábbiakban ismertetjük ennek a technikának az alapelveit, valamint annak fejlesztése és innovációja alapján kifejlesztett alapelveit.

Sanger módszer

A Sanger-módszer kifejlesztése kulcsfontosságú eseményt jelentett a molekuláris biológiában. Ez magában foglalja a DNS replikációs folyamat alapvető alkotóelemeit, amelyek általában a sejtben fordulnak elő, de hozzáadnak egy speciális komponenst: dideoxinukleotidokat.

A reakció fő alkotóelemei

- DNS polimeráz: a DNS polimeráz enzim a folyamat kritikus eleme. Ez a molekula részt vesz a DNS-szál replikációjában és szerepe az új szál szintézisében, összekapcsolva a trifoszfát-dezoxiribonukleotidokat a komplementer atomokkal.

Emlékezzünk arra, hogy a DNS-ben a tirinok (T) a hidrogénkötéseken keresztül párosulnak az adeninnel (A), míg a citozin (C) három kötésen keresztül a guaninnal (G).

- Nukleotidok: A Sanger szekvenálás kétféle nukleotidot foglal magában: a négy 2'-deoxinukleotidot (rövidítve dATP, dGTP, dCTP és dTTP) és a négy didezoxinukleotidot (ddATP, ddGTP, ddCTP és ddTTP).

Bár a dideoxinukleotidok hasonlítanak a monomerekhez, amelyek általában beépülnek a DNS-be, szerkezetükben nincs -OH csoport. Ez lehetetlenné teszi új nukleotid hozzáadását a láncba.

Ezért, amikor egy speciális nukleotidot adunk - egy teljesen véletlenszerű módon - a kialakuló láncba, a szintézis megbénul. Így a reakció végén különböző méretű láncok vannak, mindegyikben a reakciót egy másik ponton állítottuk le.

Kísérletileg négy tesztet készítenek. Mindegyik tartalmazza a kérdéses biológiai mintából kivont DNS-t, a normál nukleotidokat és a négy speciális nukleotidtípus egyikét. Vagy a speciális nukleotidokat valamilyen típusú fluoreszcens markerrel megjelöltük (lásd az alábbiakban az automatikus szekvenálást).

Az eredmények olvasása

Az első lépés a szintetizált láncok méretük szerinti elválasztása. Egyesek hosszabbak lesznek, mint mások, attól függően, hogy hol helyezték el a speciális alapokat.

Különböző biokémiai technikák léteznek, amelyek lehetővé teszik a keverék alkotóelemeinek elválasztását a méretet megkülönböztető tulajdonságként felhasználva. Sanger módszerében a különböző láncokat elektroforézissel választják el. A technika kifinomultabb változataiban kapilláris elektroforézist alkalmaznak.

Így a hosszabb szálak kevésbé haladnak, mint a rövidebb változatok. Ez a rendszer ezután egy olyan olvasón megy keresztül, amely felismeri az egyes didezoxinukleotidokban lévő markert. Ily módon a szekvencia sorrendje megismerhető.

Ez az "első generációs" módszer képes 1 kilobázisnál nem nagyobb DNS-fragmenseket leolvasni. Jelenleg a Sanger-módszert különféle laboratóriumokban használják, általában a modern változataiban. Ezenkívül a legösszetettebb technikákkal - de kevésbé pontosakkal - kapott eredmények megerősítésére használják.

Automatikus szekvenálás

Ha a szekvenálás nagyszabású, a folyamatot az automatizálás felgyorsítja. Ez a Sanger-lánc-terminációs módszer variációja, ahol az alapokat fluoreszcens termékekkel címkézik, hogy megkülönböztessék őket.

Ezt követően a reakcióterméket elektroforézissel futtatják - mindezt egyetlen sávon. Mivel minden egyes fragmens kilép a gél végső részéből, ezt gyorsan azonosítják fluoreszcens címkézésükkel, 1% körüli hibával.

A legkifinomultabb rendszerek legfeljebb 96 kapilláriscsövet tartalmaznak, amelyeket egy robothoz kapcsolt számítógép kezel. Vagyis 96 DNS-mintát lehet egyszerre tesztelni. Így az elektroforézist és az eredmények elemzését magában foglaló folyamat teljesen automatizált.

Egy nap alatt ezek a rendszerek akár 550 000 bázist szekvenálhatnak. A folyamat során az emberi munka felesleges, mindössze 15 percig tart a módszer elindítása.

Maxam-Gilbert szekvenálás

Ugyanakkor, amikor Sanger publikálta munkáját, két Allan Maxan és Walter Gilbert nevû kutatónak sikerült kidolgoznia egy másik módszert a DNS-szekvencia elõállítására. A módszer akkoriban népszerűvé vált, de később Sanger módszerének továbbfejlesztése következtében elhagyta.

A Sanger-módszerrel ellentétben a Maxan és Gilbert szekvenálás (vagy kémiai szekvenálás, mivel az is ismert) nem jár hibridizációs reakciókkal. A módszer a reagensek egyik végén történő címkézésből áll, amelyet egy tisztítási folyamat követ.

Ennek a technikának az egyik negatív aspektusa a hatalmas összetettségében és a felhasználó számára veszélyes vegyi anyagok használatában rejlik. A kémiai töréseket DMS, hangyasav, hidrazin és sók hidrazin alkalmazásával indukálják.

Folyamat

A protokoll azzal kezdődik, hogy a szál 5'-végén a 32 foszfor markerrel jelöljük, majd a nitrogén bázis kémiai módosítása megtörténik és elválasztjuk. Végül megtörténik az abasic régió hasadása.

Először rövidítse le a szekvenálni kívánt karaktersort kisebb szegmensekre. Ezt a lépést restrikciós enzimekkel hajtjuk végre, amelyek kiálló végeket eredményeznek.

Ezután a reakciót lúgos foszfatázzal hajtjuk végre, amelynek célja a foszfátcsoport eltávolítása. Így a polinukleotid-kináz felhasználható a jelölés végrehajtására.

A lánc denaturált (a két szál nyitva van). Ezután a vegyszereket felvisszük. Ezeket a hasítási reakciókat ellenőrzött módon hajtjuk végre, és ismeretes, hogy az egyes alkalmazott vegyületek milyen típusú kötéseket szakítanak meg.

Az eredmények olvasása

Mint a Sanger-módszernél, az eredmények leolvasása magában foglalja az elektroforézis rendszerben kapott láncok méret szerinti elválasztását. A poliakrilamidból álló rendszerek nagyon megfelelő felbontást eredményeznek a gél leolvasásához.

Tömeges szekvenálás

A hatalmas szekvenálás új módszerek sorozatát foglalja magában, rövidítve NGS, az angol „Next Generation Sequencing” sorozatból.

Az NGS-ként osztályozott módszerek előző DNS amplifikációs lépést igényelnek (nem működnek egyetlen molekulával). Ezenkívül az alkalmazott platformok nagyon változatosak. Az alábbiakban ismertetjük a legnépszerűbb módszerek alapelveit:

Pyrosequencing

Ez magában foglalja a pirofoszfát felszabadulásának megfigyelését, amely minden alkalommal megtörténik, amikor új nukleotidot adnak a DNS-szálhoz. Az enzimek rendszere össze van kapcsolva, így a fénykibocsátás (amelyet egy kamera érzékelhet) minden új nukleotid beépítésekor megtörténik.

A folyamat az egyes nitrogénbázisok különálló inkubálásával kezdődik, hogy ellenőrizzük, van-e fénykibocsátás. A pirozekvenálás hosszú szálakat képes olvasni, de a talált hibaarány magas.

Szintézis szekvenálás

Ez magában foglalja a jelölt nukleotidok beépítését. Ezeket a fluoreszcens komponenseket hozzáadjuk, mossuk és megjegyezzük a beépített nukleotidot. Ezután a nukleotid jelölést eltávolítják, és a szál szintézise folytatódhat. A következő lépésben egy jelölt nukleotidot is beépítünk, és a fent említett lépéseket megismételjük.

Ennek a technikának hátránya akkor fordul elő, ha a fluoreszcens markereket nem távolítják el teljesen. Ezek a kibocsátások háttér hibákat okoznak, amelyek jelentős hibákat eredményeznek.

Ligációs szekvenálás

Ez a technika különbözik a többitől, mivel nem használ DNS-polimerázt. Ehelyett e módszer kulcsfontosságú enzime a ligáz. Itt fluoreszcensen jelölt DNS-fragmenseket használunk, ezeket az enzim köti össze és kimutatható.

Ennek a technikanak a legnagyobb problémája a rövid részlethossz, amelyet képes feldolgozni.

Ion Torrent szekvenálás

Ez a technika azon H ⁺ ion mérésén alapszik, amely új nukleotidok beépítésekor szabadul fel. Az elv meglehetősen hasonló a pirosequencinghez, de sokkal olcsóbb.

Példák

Az emberi genom szekvenálása

Az emberi genom szekvenálása a biológia egyik legígéretesebb kihívása, és a tudomány történetének egyik leghíresebb rivalizálása. Valójában a projektben részt vevő tudósok számára a genom szekvenálása versenyré vált.

1990-ben a híres tudós, a Nobel-díjas James Watson vezetésével elindította az úgynevezett "emberi genom projektet". Egy év után, 1991-ben, Venter vállalja Watson "legyőzésének" és az előtte lévő genom szekvenálásának kihívását. 1992-ben azonban Watson visszavonult és a parancsot egy másik kutató vette át.

1995-ben Venter bejelentette sikerét a bakteriális genom teljes szekvenálásában véletlenszerű szekvenálási módszerrel. Hasonlóképpen, az ellenfél egy évvel később bejelentette az élesztő genom szekvenálását.

2000-ben a diplomát megszüntették. Mindkét cég közzétette az előzetes teljes genom eredményeit a tudomány két legelismertebb folyóiratában: a természet és a tudomány.

A tudósok azonban tovább dolgoztak a javaslatok fejlesztésén, és 2006-ban befejezték az egyes emberi kromoszómák szekvenciáit.

Fontosság és alkalmazások

Az olyan fontos molekula, mint a DNS nukleotidjainak sorrendjének ismerete értékes a biológusok és a kapcsolódó szakemberek számára. Ez a polinukleotid-lánc tartalmazza az összes információt, amely az élet minden formájának kialakításához és fenntartásához szükséges.

Ezen okok miatt a szekvencia ismerete elengedhetetlen a biológiai kutatásokhoz. Alapvetően a szekvenálás lehetővé teszi a biológiai rendszerek egyik legfontosabb tulajdonságának mérését és a különbségek megállapítását közöttük.

A szekvenálást széles körben használják az taxonómusok és a szisztematikusok, mivel bizonyos DNS-szekvenciák lehetővé teszik kritériumok megállapítását annak megállapítására, hogy két organizmus ugyanabba a fajba tartozik-e, és amellett, hogy hipotéziseket tehetnek fel a közöttük levő filogenetikai kapcsolatokról.

Ezenkívül a DNS-szekvenálás alkalmazható az orvostudományban és a diagnosztikában is. Például vannak olyan olcsó és elérhető rendszerek, amelyek a szekvenálás révén lehetővé teszik bizonyos betegségek (például rák) kialakulásának hajlandóságát úgynevezett egyetlen nukleotid polimorfizmus (SNP) alkalmazásával.

A kriminalisztikai és az igazságügyi nyomozásokat szintén gazdagították szekvenálási technikákkal, amelyek megbízható bizonyítékként szolgálhatnak egy adott személy bűncselekményben való részvételére.

Irodalom

1. Heather, JM, & Chain, B. (2016). A szekvenciák szekvenciája: a szekvenáló DNS története. Genomika, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK és Mardis, ER (2013). A következő generációs szekvenáló forradalom és annak hatása a genomikára. Cell, 155 (1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Tudományos versengés. A Galileótól az emberi genom projektig. Szerkesztõ Paraninfo.
4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, AR (1977). DNS-szekvenálás láncot lezáró inhibitorokkal. A Nemzeti Tudományos Akadémia folyóiratai, 74 (12), 5463-5467.
5. Schuster, SC (2007). A következő generációs szekvenálás átalakítja a mai biológiát. Természetes módszerek, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (szerk.). (2014). Következő generációs szekvenálás. Caister Academic Press.