REKOMBINÁNS DNS: TECHNIKA, ALKALMAZÁSOK ÉS ALAPOK - BIOLÓGIA - 2026

A rekombináns DNS (rDNS vagy rDNS) egy mesterséges nukleinsavmolekula, amelyet laboratóriumban hoztak létre az érdekelt szervezetek két szegmensének integrálásával. Kiméra DNS-ként is ismert, hibrid tulajdonságának köszönhetően. Az ilyen típusú DNS nem található meg a természetben.

Ennek előállításához az alapvető módszertan a következőket foglalja magában: (a) egy cél-DNS kiválasztása és beillesztése egy másik DNS-fragmentumba (általában egy bakteriális plazmidba); (b) e plazmid bejuttatása egy baktériumba, (c) a baktériumok szelektálása antibiotikumok segítségével és végül (d) a gén expressziója.

Forrás: pixabay.com

A módszer egy olyan enzimkészlet előnyeit használja ki, amelyek lehetővé teszik a DNS-fragmensek másolását és beillesztését a kutató megítélése szerint.

A rekombináns technológia célja a legtöbb esetben egy fehérje (rekombináns fehérje néven ismert) expressziója, amelyet a molekuláris biológus kíván a jövőbeni kutatáshoz, vagy kereskedelmi és terápiás értéket képviselő fehérje - például humán inzulin - létrehozása céljából. például.

A rekombináns DNS technika alapjai és alkalmazása a géntechnikában

A molekuláris biológia központi dogma

Az összes szerves lénynek, amelyet ismerünk, több tulajdonsága van. Az egyik a genetikai anyag természete és a fehérjék előállítási módja - ez a folyamat a molekuláris biológia központi „dogma” néven ismert.

Néhány vírus kivételével az összes organizmus genetikai információt tárol a DNS-ben (dezoxiribonukleinsav), amelyet nagyon kompakt és szervezett módon gyűjtenek a sejtmagjában.

A génexpresszió érdekében a DNS-molekulát átírják messenger RNS-re, és utóbbit az aminosavak nyelvére, a fehérjék építőelemeire fordítják.

Mi a rekombináns DNS?

Az 1970-es és 1980-as évek között a molekuláris biológusok elkezdték kihasználni azokat a folyamatokat, amelyek a sejtben természetesen zajlanak, és képesek voltak extrapolálni azokat a laboratóriumba.

Ilyen módon állati eredetű gént (például gerinces) lehet beilleszteni egy baktérium DNS szegmensébe; vagy egy baktérium DNS-ét kombinálhatjuk vírusos DNS-sel. Így a rekombináns DNS-t úgy definiálhatjuk, mint egy molekulát, amely két különböző szervezet DNS-ből áll.

Miután létrehozták ezt a hibrid vagy rekombináns molekulát, az érdeklődő gént expresszáltatják. A kifejezés szóval utalni akarunk a fehérjévé történő transzláció folyamatára.

Restrikciós enzimek és ligázok: a folyamat kulcsa

A rekombináns DNS-technológia fejlesztésének kulcseleme a restrikciós enzimek felfedezése volt.

Ezek olyan fehérjemolekulák, amelyek képesek a DNS (nukleázok) specifikus szekvenciákra hasítására, amelyek „molekuláris ollóként” szolgálnak. Az ezen enzimek által generált fragmenseket restrikciós fragmenseknek nevezzük.

Az említett enzimek szimmetrikus vágásokat eredményezhetnek a célszekvenciában (mindkét láncban azonos magasságban) vagy aszimmetrikus vágásokat. A restrikciós enzimek működésének kulcseleme az, hogy a láncok lehasadása után "laza él" jön létre, kiegészítve az ugyanazon enzim által vágott másik éltel.

Néhány példa az ECOR 1 és Sma 1. Jelenleg több mint 200 restrikciós enzim típus ismert és kereskedelemben beszerezhető.

Használatához az ollót a ragasztóval kell kísérni. A DNS (amelyet korábban restrikciós enzimekkel kezeltek) ezt a záródó hatását ligázok hajtják végre.

Technika: hogyan lehet egy organizmus DNS-ét mesterségesen módosítani a laboratóriumban?

Az alábbiakban leírjuk azokat a fő lépéseket, amelyekre a rekombináns DNS technológia szükségessé válik. Mindezt szakemberek végzik a molekuláris biológiai laboratóriumban.

Mi az a "klón"?

Mielőtt folytatnánk a kísérleti protokollt, meg kell jegyeznünk, hogy a molekuláris biológiában és a biotechnológiában a "klón" és a "klón" ige széles körben használatos. Ez zavart okozhat.

Ebben az összefüggésben nem egy teljes organizmus klónozására (mint például a híres Dolly juh esetében) gondolunk, hanem egy DNS-darab klónozására, amely gén lehet. Vagyis a szekvencia sok - genetikailag azonos - példányát elkészíti.

1. DNS izolálása és kinyerése

Az első lépés annak eldöntése, hogy melyik sorozatot szeretné használni. Ez teljes mértékben a kutatótól és munkájának céljaitól függ. Ezt a DNS-t ezután el kell különíteni és tisztítani. Az ennek elérésére szolgáló módszerek és eljárások a testtől és a szövettől függnek.

Általában egy darab szövetet veszünk, és lizáló pufferben kezeljük proteináz K-val (proteolitikus enzim), majd a DNS-t extraháljuk. Ezt követően a genetikai anyag kis részletekre osztódik.

2. Klónozó vektor

Az előkészítő lépések után a kutató arra törekszik, hogy a kérdéses DNS szegmenst beépítse egy klónozó vektorba. Mostantól a DNS ezen szegmensét fehér DNS-nek nevezzük.

A plazmidok

Az egyik leggyakrabban használt vektor a baktérium eredetű plazmidban. A plazmid egy kétszálú, kör alakú DNS-molekula, amely természetesen megtalálható a baktériumokban. Idegen a baktérium kromoszómájában - azaz extrakromoszómálisak, és természetesen megtalálhatók ezekben a prokariótákban.

A vektor alapelemei a következők: (a) a replikáció kezdete, amely lehetővé teszi a DNS szintézist; (b) szelekciós szer, amely lehetővé teszi a plazmidot a cél-DNS-sel hordozó szervezetek, például valamilyen antibiotikummal szembeni rezisztencia azonosítását; és (c) multiklónozó hely, ahol megtalálhatók a restrikciós enzimek által felismerhető szekvenciák.

Az első sikeres rekombináns DNS-t a laboratóriumban az E. coli baktériumból a pSC101 plazmidba klónoztuk. Ez tartalmaz egy restrikciós helyet az EcoRI restrikciós enzim számára és egy gént, amely az antibiotikummal szembeni rezisztenciára vonatkozik, a replikáció eredetén kívül.

A cél DNS beillesztését a plazmidba az előző szakaszban leírt restrikciós enzimek és ligázok molekuláris eszközeivel hajtjuk végre.

A fennmaradó vektor típusok

A plazmidokon kívül a DNS beilleszthető más vektorokba is, mint például a lambda bakteriofág, kozmidok, YAC-k (élesztő mesterséges kromoszómák), BAC-k (bakteriális mesterséges kromoszómák) és fagemididok.

3. Rekombináns DNS bevezetése

Miután megkaptuk a rekombináns DNS-molekulát (a plazmidban vagy más vektorban érdekes gén), bejuttatjuk egy gazdaszervezetbe vagy gazdaszervezetbe, amely baktérium lehet.

Az idegen DNS bejuttatására egy baktériumba baktérium-transzformációnak nevezett technikát alkalmaznak, ahol a szervezetet kétértékű kationokkal kezelik, amely hajlamosvá teszi a DNS felvételére.

Módszertanilag nem garantálhatjuk, hogy kultúránk baktériumainak 100% -a hatékonyan elfoglalta rekombináns DNS-molekulánkat. Itt játszik a plazmid azon része, amely az antibiotikum-rezisztenciát tartalmazza.

Így azok a baktériumok, amelyek felvették a plazmidot, rezisztensek lesznek egy bizonyos antibiotikummal szemben. Kiválasztásukhoz elegendő az említett antibiotikum felvitele és a túlélők bevitele.

4. A betakarítás a fehérjét

A baktériumok rekombináns DNS-sel történő kiválasztása után a gazdaszervezet enzimatikus mechanizmusát alkalmazzuk az érdeklődésre számot tartó fehérjetermék előállításához. Ahogy a baktériumok szaporodnak, a plazmid továbbadódik utódaiknak, tehát nem osztódik el.

Ez az eljárás a baktériumokat egyfajta fehérje "gyárként" használja. Később meglátjuk, hogy ez nagyon releváns eljárás a hatékony orvosi kezelések fejlesztésében.

Miután a tenyészet készen áll és a baktériumok nagy mennyiségű fehérjét termeltek, a sejtet lizálják vagy megbontják. Biokémiai technikák széles köre létezik, amelyek lehetővé teszik a fehérjék fizikai-kémiai tulajdonságaik szerinti tisztítását.

Egy másik kísérleti környezetben valószínűleg nem érdekli a fehérje előállítása, hanem inkább önmagában a DNS-szekvencia megszerzése. Ebben az esetben a plazmidot felhasználnák az érdeklődésre számot tartó fragmens több példányának elkészítéséhez, hogy elegendő mennyiségű cél-DNS legyen a vonatkozó kísérletek elvégzéséhez.

Alkalmazások

A rekombináns DNS-technológia végtelen számú lehetőséget nyitott meg a molekuláris biológiában, a biotechnológiában, az orvostudományban és más kapcsolódó területeken. Legkiemelkedőbb alkalmazásai a következők.

Genetikai elemzés

Az első alkalmazás közvetlenül kapcsolódik a molekuláris biológiai laboratóriumokhoz. A rekombináns DNS technológia lehetővé teszi a kutatók számára, hogy megértsék a gének normális működését, és a generált fehérjék felhasználhatók további kutatásokhoz.

Gyógyszeripar

A rekombináns DNS eljárás alkalmazásával előállított fehérjék gyógyászatban alkalmazhatók. Két nagyon releváns példa a humán inzulinra és a növekedési hormonra, amelyet olyan betegekben alkalmaznak, akiknél ez a fehérje hiányzik.

A rekombináns DNS-nek köszönhetően ezek a fehérjék anélkül előállíthatók, hogy szükség lenne egy másik emberből történő extrakcióra, ami további módszertani szövődményeket és egészségügyi kockázatokat jelent. Ez elősegítette a számtalan beteg életminőségének javulását.

Irodalom

1. Baca, LEL és Álvarez, CLC (2015). Biológia 2. Grupo Editorial Patria.
2. Cooper, GM, Hausman, RE, és Hausman, RE (2000). A cella: molekuláris megközelítés (10. kötet). Washington, DC: ASM sajtó.
3. Devlin, TM (2004). Biokémia: tankönyv klinikai alkalmazásokkal. Megfordítottam.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., és Hou, H. (2016). A rekombináns DNS-technológia szerepe az élet javításában. Nemzetközi genomikai folyóirat, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP, és Mindan, P. (1996). Patológiai anatómia. Elsevier Spanyolország.
6. Tortora, GJ, Funke, BR, & Case, CL (2007). Bevezetés a mikrobiológiába. Panamerican Medical Ed.
7. The, MJ (1989). Humán inzulin: a DNS-technológia első gyógyszere. American Journal of Health-System Pharmacy, 46 (11_suppl), S9-S11.