MÜELLER HINTON AGAR: ALAP, ELŐKÉSZÍTÉS ÉS FELHASZNÁLÁSOK - BIOLÓGIA - 2026

A Mueller Hinton Agar nem szelektív, a szilárd tápanyag húsinfúzióból, peptonsav-kazeinből, keményítőből, agarból és desztillált vízből áll. Ez a közeg kiváló mikrobiális növekedést tesz lehetővé a legtöbb gyorsan növekvő baktérium számára.

Eredetileg John Howard Müeller és Jane Hinton készítette, hogy tápanyagigényes baktériumokat, például Neisseria gonorrhoeae és Neisseria meningitidis izoláljon. Jellemzői miatt ideálisnak bizonyult az antibiotikumokkal szembeni érzékenység vizsgálatához, megbízható és reprodukálható eredményeket szolgáltatva.

Antibiogramok (Müeller Hinton agar). Forrás: Dr. Graham Beards, az en.wikipedia

Ezért a Müeller Hinton agar a Klinikai és Laboratóriumi Szabványügyi Intézet (CLSI) és az Antimikrobiális érzékenységi tesztek Európai Bizottsága által elfogadott tápközeg az antimikrobiális érzékenységi teszt elvégzéséhez Kirby korongdiffúziós módszerrel és Bauer.

bázis

Nem szelektív tápközegként kiválóan alkalmas a legtöbb patogén baktérium növekedésére.

Másrészt az egyszerű összetétele megkönnyíti az anyagok diffundálódását rajta, ez alapvető jellemzője a korongdiffúziós módszerrel történő érzékenységi vizsgálatnak.

Jellemzői az is, hogy alacsony mennyiségű inhibitort tartalmaz, amely lehetővé teszi a szulfonamidok, a trimetoprim és a tetraciklinek hatékony értékelését.

Nem szabad azonban figyelembe venni, hogy a közegnek meg kell felelnie bizonyos feltételeknek annak megfelelő működése érdekében, ideértve a következőket:

A pH, az agar mélységének és a timin, timidin, Ca ⁺⁺, Mg ⁺⁺ és Zn ⁺⁺ megfelelő koncentrációjának beállítása.

Azt is tudnia kell, hogy a módszertan egységesített, ezért minden paraméternek teljesülnie kell, mint például:

Az oltóanyag koncentrációja, az antibiotikum korongok koncentrációja és tartósítása, a megfelelő számú korong elhelyezése az agaron, a korong közötti távolság, egyes antibiotikumok stratégiai elhelyezése, a légkör, a hőmérséklet és az idő inkubáció.

Készítmény

Mérjünk ki 37 g dehidratált Müeller Hinton tápközeget és oldjuk fel 1 liter desztillált vízben. A tápközeget melegítjük keverés közben az oldódás elősegítésére. Forraljuk 1 percig.

Autokláv 121 ° C-on 15 percig sterilizálni. Az autoklávból történő eltávolításkor a lombikot 50 ° C-os vízfürdőbe kell helyezni, hogy lehűljön. Öntsünk 25-30 ml-t steril, 10 cm átmérőjű Petri-csészékbe.

A tányérok átlagos vastagságának 4 mm-nek kell lennie (ideális), 3-5 mm tartományban megengedett.

Ha kívánatos vér-agar előállítása Müeller Hinton agar felhasználásával, öntsön 5% -ra steril és defibrillált bárányvért, mielőtt a tányérokra tálalná.

A tápközeg végső pH-jának 7,2 és 7,4 között kell lennie.

Fektesse be és tárolja hűtőszekrényben felhasználásig. Használat előtt hagyja, hogy a lemez szobahőmérsékletre melegedjen.

Az elkészített táptalaj színe világos bézs színű.

Alkalmazások

A legtöbb gyorsan növekvő nem igényes kórokozó antibiotikumokkal vagy antibiotikumokkal szembeni érzékenységi vizsgálatának elvégzésére szolgál.

Ha az agart vérrel egészítik ki, akkor azt igényes mikroorganizmusok, például a Streptococcus pneumoniae, a Haemophilus sp, a Neisseria meningitidis, antibiotikumainak elvégzésére használják. A Legionella pneumophila izolálására is felhasználták.

Antibiogram technika

Elvégzése előtt antibiogram, bakteriális oldatot egyenértékű 1,5 x 10 ⁸ sejt kell készülnie.

Ehhez 3-4 tiszta tenyészetből álló kolóniát veszünk és szuszpen-zálunk szójabab trypticáz-táptalajban vagy Müeller Hinton-táptalajban, 2-6 órán át inkubáljuk, és a koncentrációt steril sóoldattal állítjuk be, összehasonlítva a Mac Farland 0,5%.

Ha mikroorganizmusokat igényelnek, akkor a kolóniák közvetlenül szuszpendálhatók 0,5% -os Mac Farland koncentrációig. Ezt követően a Müeller Hinton lemezt az előkészített baktériumoldattal impregnált tamponnal beoltják.

Ehhez a tampont bemerítik az oldatba, majd a felesleges folyadékot eltávolítják a cső falához való nyomással. Közvetlenül ezután a tamponot átvisszük a teljes felületen, anélkül, hogy érintetlenül maradna, majd a lemezt kissé elforgatjuk, és újra beoltjuk. A műveletet még kétszer megismételjük.

Hagyja állni 10 percig, majd helyezze be az antibiotikum-lemezeket steril csipesszel, 24 mm-es rést hagyva közöttük. Miután az egyes lemezeket az agarra helyezte, az összes lemezt finoman nyomja meg a csipesszel, hogy megbizonyosodjon arról, hogy jól tapadnak-e.

A folyamat befejezése után a lemezt megfordítják és 35–37 ° C hőmérsékleten inkubálják aerobiosis közben 16–18 órán át. Ha igényes mikroorganizmus, érdemes lehet a mikroaerofília, és ha az antiiogram oxacillin lemezeket tartalmaz, akkor 24 órán belül el kell olvasni.

Az egyes halogók átmérőjének meghatározásához vonalzót használnak. Az eredményeket mm-ben kell rögzíteni. Ezt követően a kapott értékeket korrelálják a határértékek táblázataival, amelyeket a jelenlegi CLSI kézikönyv tett közzé.

A gátlási halo mérése. Forrás: USCDCP, Pixnio.com

Jelezze érzékenynek (S), közbensőnek (I) vagy ellenállónak (R), esettől függően.

Az antibiotikumokat az izolált mikroorganizmus és a fertőzés típusa szerint választják ki.

Az antibiotikumok stratégiai elhelyezését néha szem előtt kell tartani a rezisztencia fenotípusos mintáinak feltárása érdekében.

Stratégiai lemezes elhelyezés a Müeller Hinton agaron

Enterobaktériumok esetén a klavulánsav korongot a 3. és a 4. generációs cefalosporinokkal szemben kell elhelyezni. A tojás alakú kiterjesztés azt jelzi, hogy a törzs kiterjesztett spektrumú béta-laktamázok (ESBL) termelője. Ez azt jelenti, hogy a beteget nem szabad cefalosporinnal kezelni.

A kiterjesztett spektrumú béta-laktamáz (ESBL) termelésének fenotípusos expressziója Escherichia coli törzsben. Forrás: A fotó készítette MSc. Marielsa gil

Staphylococcus-ban fontos, hogy az eritromicin vagy azitromicin korongot a klindamicin korong elé helyezzék (D-teszt).

Az eritromicinben rezisztens halogén és a klindamicin-halogásban ellaposodás azt jelzi, hogy a törzs törzs által indukálható klindamicin-rezisztenciával (ICR) rendelkezik. Ez azt jelenti, hogy a klindamicin-kezelés nem lesz hatékony.

Az indukálható AMP C törzsek keresésére az Enterobacteriaceae-ban és néhány nem erjesztő grammnegatív rudaval, a tazobaktán-ceftazidim, a cefoxitin vagy a piperacillin korongokkal szemben egy imipenem korong található, 27 mm távolságban.

Az imipenem felé néző egyik lemezen levő halogén indukálható AMP C jelenlétét jelzi.

A konstitutív C-AMP keresésére egy 500 μg kloxacillin korongot ceftazidim (30 μg) és cefotaxim (30 μg) érintkeznek 25 mm távolságban. A cefalosporinok bármelyikének szélesebb halogénje pozitivitást jelez.

A kloxacillin korong kicserélhető egy 9 mm-es Whatman No. 6 szűrőpapírral, amely fenil-bórsavval (400 μg) impregnálva van, 18 mm távolságban. Az előzővel megegyezően értelmezzük.

Végül, különösen a Pseudomonas aeruginosa-ban a metallobetalaktamaszák képződésének vizsgálatához 10 µl etilén-diamin-tetraecetsavval (EDTA 750 µg) és tioglikolsavval (SMA 300 µg) impregnált korongot használunk, amelyet az imipenem és a meropenem lemezekkel szembe kell nézni. 15 mm távolságra.

A teszt pozitív, ha az imipenem vagy a meropenem haloszálak kiszélesednek az EDTA / SMA lemez felé. Ezt az eredményt meg kell erősíteni a módosított Hodge-teszttel.

Ez a módszer egy Escherichia coli ATCC 25922 törzs oltását jelenti a Müeller Hinton lemezen. Az imipenem korongot helyezünk a lemez közepére, majd egy csíkot készítünk a lemezről a perifériára a feltételezett P. aeruginosa törzs segítségével. Lemezenként legfeljebb 4 törzs tesztelhető.

A teszt akkor lesz pozitív, ha az nyújtó jel körül van az imipenem halo torzulásának zónája.

A hibás eredmények okai

- A rosszul megőrzött antibiotikum korongok hamis rezisztenciát válthatnak ki. Például az oxacillin korong nagyon érzékeny a hőmérsékleti változásokra.

-A tápközeg pH-ja a megadottnál alacsonyabb (savas) alacsonyabb halókat eredményez az aminoglikozidokban és makrolidokban (a téves rezisztencia kockázata), és nagyobb halókat eredményez a penicillinben, a tetraciklinben és a novobiocinban (a téves érzékenység kockázata).

-Ha a pH-érték meghaladja a jelzett (lúgos) értéket, akkor a fentiekben leírt hatások megfordulnak.

-A magas timin- és timidin-koncentrációjú médiumok befolyásolják a szulfonamidok és a trimetoprim gátlásának szignifikáns csökkentését.

-A magas kalcium- és magnéziumkoncentráció az aminoglikozidok, a polymyxin B és a tetraciklinek hamis rezisztenciáját váltja ki a Pseudomonas aeruginosa törzsekkel szemben.

-A alacsony kalcium- és magnéziumkoncentrációk hamis érzékenységet okoznak az aminoglikozidok, a polymyxin B és a tetraciklinok ellen a Pseudomonas aeruginosa törzsekkel szemben.

-A cink jelenléte befolyásolja a karbapenem korongok (imipenem, meropenem és ertapenem) eredményeit.

A 3 mm alatti közeg vastagsága hamis érzékenységet eredményez, míg az 5 feletti vastagság hamis ellenállást eredményez.

-A korongok mobilizálása az antiagrammon deformált halókat eredményez, mivel az antibiotikumok azonnali ürítése történik.

- A nagyon gyenge oltóanyagok befolyásolják az eredményeket, mivel az agarban nem lesz egyenletes vagy összefolyó növekedés - ez egy szükséges feltétel a gátló haloszlók méréséhez, amellett, hogy a halók normálnál nagyobb adhatnak.

-A túlméretezett oltóanyag a normálnál kisebb haloszlopokat eredményezhet.

-Nem, ha a lemezek közötti távolságot figyelembe vesszük, az egyik halo átfedésben van a másikkal, és nem olvashatók helyesen.

-Incubate CO ₂ növekszik a méret a fényudvar a tetraciklin és a meticillin lemezeket.

-Inkubálva 35 ° C alatti hőmérsékleten nagyobb halosok képződnek.

-A vér hozzáadása csökkenti a szulfa-halo méretét.

Korlátozás

Az antibiotikum mikrobiológiai organizmus ellen mutatott érzékenysége (in vitro) nem garantálja, hogy in vivo működni fog.

QA

Annak megismeréséhez, hogy a tápközeg elegendő mennyiségű timint tartalmaz - be kell ültetni az Enterococcus faecalis ATCC 29212 törzset, és meg kell vizsgálni a trimetoprim-szulfametoxazolra (SXT) való érzékenységet, ennek 20% -nál vagy annál nagyobb halo-halmaznak kell lennie, hogy kielégítő legyen.

Irodalom

1. "Müller-Hinton agar." Wikipédia, a szabad enciklopédia. 2018. november 16., 12:23 UTC. 2019. január 27., 04:22
2. Forbes B., Sahm D., Weissfeld A. (2009). Bailey és Scott mikrobiológiai diagnózisa. 12 ed. Szerkesztő Panamericana SA Argentina.
3. Cona E. A jó érzékenységi vizsgálat feltételei agar diffúziós teszttel. Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Difco Francisco Soria Melguizo laboratórium. Müeller Hinton agar agar 5% juhokkal. 2009.Támogatható:
5. BD Müeller Hinton II agar laboratórium. 2017.Attól elérhető:.bd.com
6. Britannia Laboratories. Müeller Hinton agar. 2015.Attól elérhető: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiológiai diagnózis. 5. kiadás Szerkesztő Panamericana SA Argentina.
8. Martínez-Rojas D. AmpC-típusú béta-laktamázok: Általános ismeretek és módszerek a fenotípusos kimutatáshoz. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2009-ben; 29 (2): 78-83. Elérhető a scielo.org oldalon.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. A metallobetalaktamaszok fenotípusos kimutatása a Pseudomonas aeruginosa klinikai izolátumaiban. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Elérhető a scielo.org oldalon.