RESTRIKCIÓS ENZIMEK: FUNKCIÓK, TÍPUSOK ÉS PÉLDÁK - BIOLÓGIA - 2025

A restrikciós enzimek olyan endonukleázok, amelyeket bizonyos archaea és baktériumok alkalmaznak a vírusok elterjedésének gátlására vagy "korlátozására". Különösen gyakoriak a baktériumokban, és részét képezik az idegen DNS-sel szembeni védelmi rendszerüknek, amelyet restrikciós / módosító rendszerként ismertek.

Ezek az enzimek katalizálják a kettős sávú DNS hasítását meghatározott helyeken, reprodukálható módon és kiegészítő energia felhasználása nélkül. A legtöbb esetben szükség van olyan kofaktorok jelenlétére, mint például magnézium vagy más kétértékű kationok, bár néhányukban ATP vagy S-adenozil-metionin is szükséges.

HindIII restrikciós enzim reakciórendszer (Forrás: Helixitta a Wikimedia Commons segítségével)

A restrikciós endonukleázokat 1978-ban fedezte fel Daniel Nathans, Arber Werner és Hamilton Smith, akik felfedezésükért orvosi Nobel-díjat kaptak. A neve általában abból a szervezetből származik, ahol először megfigyelték.

Az ilyen enzimeket széles körben használják a DNS-klónozási módszerek és más molekuláris biológiai és géntechnikai stratégiák kidolgozásában. Specifikus szekvencia-felismerési tulajdonságuk és a szekvenciák felismerési helyek közelében történő vágásának képessége hatékony eszközökké teszik őket a genetikai kísérletekben.

Azokat a restrikciós enzimek által generált fragmenseket, amelyek egy adott DNS-molekulára hatottak, felhasználhatjuk az eredeti molekula "térképének" létrehozásához az információk felhasználásával azon helyekről, amelyekben az enzim vágja a DNS-t.

Bizonyos restrikciós enzimeknek azonos felismerési helyük lehet a DNS-en, de nem feltétlenül vágják meg ugyanolyan módon. Így vannak olyan enzimek, amelyek vágják a tompa végeket, és olyan enzimek, amelyek vágják a bal oldali kohéziós végeket, amelyeknek a molekuláris biológiában eltérő alkalmazása van.

Jelenleg több száz különböző kereskedelemben kapható restrikciós enzim létezik, amelyeket különböző kereskedelmi házak kínálnak; Ezek az enzimek "egyedi" molekuláris ollókként működnek különböző célokra.

Jellemzők

A restrikciós enzimek a polimerázok ellentétes funkcióját látják el, mivel hidrolizálják vagy megbontják az észterkötést a nukleotidlánc szomszédos nukleotidjai közötti foszfodiészter-kötésen belül.

A molekuláris biológiában és a géntechnikában széles körben használják az expressziós és klónozási vektorok felépítéséhez, valamint a specifikus szekvenciák azonosításához. Felhasználhatók rekombináns genomok felépítésében is, és nagy biotechnológiai potenciállal rendelkeznek.

A génterápia legújabb előrelépései során a restrikciós enzimeket jelenleg alkalmazzák bizonyos gének bevitelére olyan vektorokba, amelyek hordozók az ilyen gének élő sejtekbe történő szállításához, és amelyek valószínűleg képesek beilleszkedni a sejtgenomba, hogy elvégezzék állandó változások.

A cselekvés mechanizmusa

A restrikciós enzimek katalizálhatják a kettős sávú DNS hasítását, bár egyesek képesek felismerni az egysávos DNS-szekvenciákat és akár az RNS-t is. A vágás a sorozatok felismerése után történik.

A hatásmechanizmus az egyes DNS-szálak vázában a foszfátcsoport és a dezoxiribóz közötti foszfodiészter-kötés hidrolíziséből áll. Számos enzim képes vágni azon a helyen, amelyet felismer, míg mások 5 és 9 bázispár között vágnak előtte vagy után.

Ezek az enzimek általában a foszfátcsoport 5'-végén levágnak, és olyan DNS-fragmenseket eredményeznek, amelyeknek 5'-foszforil-vége és 3'-terminális hidroxilcsoportja van.

Mivel a fehérjék nem érintkeznek közvetlenül a DNS felismerési helyével, ezeket egymás után kell áthelyezni mindaddig, amíg a specifikus helyet el nem érik, valószínűleg a DNS-szál "csúszó" mechanizmusainak segítségével.

Az enzimatikus hasítás során a DNS-szálak mindegyikének foszfodiészterkötése a restrikciós enzimek egyik aktív helyén helyezkedik el. Amikor az enzim elhagyja a felismerési és hasítási helyet, akkor nem specifikus, átmeneti asszociációk révén.

típusai

Jelenleg ötféle restrikciós enzim ismert. Itt található mindegyik rövid leírása:

I. típusú restrikciós enzimek

Ezek az enzimek nagy pentamer fehérjék, három alegységgel, az egyik a restrikcióval, az egyik a metilezéssel és egy a szekvencia felismerésével a DNS-ben. Ezek az endonukleázok olyan multifunkcionális proteinek, amelyek képesek katalizálni a restrikciós és módosító reakciókat, ATPáz aktivitással és DNS topoizomerázzal is rendelkeznek.

Az ilyen típusú enzimek voltak az első endonukleázok, amelyeket felfedeztek, először az 1960-as években tisztítottak, és azóta nagy mélységben tanulmányozták.

Az I. típusú enzimeket nem használják széles körben biotechnológiai eszközként, mivel a hasítási hely változtatható távolságra akár 1000 bázispárt is lehet a felismerési helytől, ami megbízhatatlanná teszi őket a kísérleti reprodukálhatóság szempontjából.

II. Típusú restrikciós enzimek

Ezek olyan enzimek, amelyek homodimerekből vagy tetramerekből állnak, és amelyek a DNS-t a meghatározott helyeken 4–8 bp hosszúságban vágják le. Ezek a hasítási helyek tipikusan palindromosak, vagyis felismerik azokat a szekvenciákat, amelyeket mindkét irányban azonos módon olvasnak.

A baktériumokban található II típusú restrikciós enzimek nagy része elvágja a DNS-t, amikor felismeri annak idegen jellegét, mivel az nem rendelkezik olyan tipikus módosításokkal, amelyekkel a saját DNS-ének lennie kellene.

Ezek a legegyszerűbb restrikciós enzimek, mivel a DNS-szekvenciák felismeréséhez és levágásához nincs szükség más magnéziumra (Mg +) kapcsolódó kofaktorra.

A II. Típusú restrikciós enzimek pontossága az egyszerű szekvenciák pontos helyek felismerésében és felvágásában teszi őket a molekuláris biológia legtöbb ágában a legszélesebb körben használt és nélkülözhetetlen elemekké.

A II. Típusú restrikciós enzimek csoportján belül több alosztály létezik bizonyos tulajdonságok alapján, amelyek mindegyikére jellemzőek. Ezen enzimek osztályozása az ábécé betűinek hozzáadásával történik, az A-tól Z-ig az enzim neve után.

Az alosztályok közül néhány, amelyek felhasználhatóságukról legismertebbek:

IIA alosztály

Különböző alegységek dimerjei. Felismerik az aszimmetrikus szekvenciákat, és ideális prekurzorként használják a vágó enzimek előállításához.

IIB alosztály

Egy vagy több dimerből állnak, és a felismerő szekvencia mindkét oldalán vágják a DNS-t. A DNS mindkét szálát egy bázispár intervallummal vágják le a felismerési hely előtt.

IIC alosztály

Az ilyen típusú enzimek polipeptidek, amelyek a DNS-szálak megosztási és módosítási funkcióival rendelkeznek. Ezek az enzimek aszimmetrikusan elvágják mindkét szálat.

IIE alosztály

Ezen alosztály enzimeit a leggyakrabban használják a géntechnikában. Katalitikus helyük van, és általában alloszterikus effektorra van szükség. Ezeknek az enzimeknek kölcsönhatásba kell lépniük felismerési szekvenciájuk két példányával a hatékony hasítás elvégzéséhez. Ezen alosztályon belül vannak az EcoRII és az EcoRI enzimek.

III. Típusú restrikciós enzimek

A III. Típusú restrikciós endonukleázok csak két alegységből állnak, az egyik felelős a DNS felismeréséért és módosításáért, míg a másik a szekvencia hasításáért.

Ezeknek az enzimeknek két kofaktorra van szükségük működésükhöz: ATP és magnézium. Az ilyen típusú restrikciós enzimek két aszimmetrikus felismerési helyet tartalmaznak, ATP-függő módon transzlokálják a DNS-t, és 20-30 bp közötti távolságra vágják a felismerési hely mellett.

IV. Típusú restrikciós enzimek

A IV. Típusú enzimeket könnyű azonosítani, mivel metilációs jelekkel vágják a DNS-t, és több különböző alegységből állnak, amelyek felelősek a DNS-szekvencia felismeréséért és kivágásáért. Ezek az enzimek GTP-t és kétértékű magnéziumot használnak kofaktorokként.

A specifikus hasítási helyek közé tartoznak azok a nukleotid szálak, amelyek metilált vagy hidroxi-metilezett citozin csoportokkal rendelkeznek a nukleinsavak egyikén vagy mindkét szálán.

V típusú restrikciós enzimek

Ez az osztályozás a CRISPER-Cas típusú enzimeket csoportosítja, amelyek azonosítják és kivágják a behatoló szervezetek specifikus DNS-szekvenciáit. A Cas enzimek egy CRISPER szintetizált vezető RNS-szálat használnak az inváziós szervezetek felismerésére és megtámadására.

Az V. típusú osztályba sorolt ​​enzimek az I, II és II típusú enzimek alapján felépített polipeptidek. Vághatják szinte bármilyen szervezet DNS-szelvényeit, széles hosszúságú. Rugalmasságuk és könnyű használatuk miatt ezek az enzimek ma a géntechnikában a legszélesebb körben alkalmazott eszközök, a II. Típusú enzimek mellett.

Példák

Restrikciós enzimeket használtak a DNS polimorfizmusok kimutatására, különösen a populációgenetikai vizsgálatokban és az evolúciós vizsgálatokban a mitokondriális DNS felhasználásával annak érdekében, hogy információt szerezzenek a nukleotidszubsztitúciók mértékéről.

Jelenleg a baktériumok különböző célokra történő transzformációjához használt vektorok multiklónozó helyekkel rendelkeznek, ahol több restrikciós enzim felismerési helyét találják.

Ezek közül az enzimek közül a legnépszerűbbek az EcoRI, II, III, IV és V, amelyeket először kaptak és írtak le az E. coliból; HindIII a H. influenzae-ból és BamHI a B. amyloliquefaciens-ből.

Irodalom

1. Bickle, TA és Kruger, DH (1993). A DNS-restrikció biológiája. Mikrobiológiai áttekintés, 57 (2), 434–450.
2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA, és Horvath, P. (2007). A CRISPR megszerzett ellenállást biztosít a vírusok ellen a prokariótákban. Science, 315 (március), 1709–1713.
3. Goodsell, D. (2002). A molekuláris perspektíva: Restrikciós endonukleázok. A rákgyógyászat őssejtjeinek alapjai, 20., 190–191.
4. Halford, SE (2001). Ugrás, ugrás és hurok restrikciós enzimekkel. Biochemical Society Transactions, 29, 363-373.
5. Jeltsch, A. (2003). A faj azonosságának fenntartása és a baktériumok specifikációjának ellenőrzése: új funkció a restrikciós / módosító rendszerek számára? Gene, 317, 13-16.
6. Krebs, J., Goldstein, E., és Kilpatrick, S. (2018). Lewin XII Genes (12. kiadása). Burlington, Massachusetts: Jones és Bartlett Learning.
7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N.,… She, Q. (2015). Az I. és a III. Típusú CRISPR-Cas rendszerek genomszerkesztésre történő felhasználása. Nukleinsavak kutatása, 1–12.
8. Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA és Wilson, GG (2013). I. típusú restrikciós enzimek és rokonok. Nukleinsavak kutatása, 1–25.
9. Nathans, D. és Smith, HO (1975). Restrikciós endonukleázok a DNS-molekulák elemzésében és átalakításában. Annu. Biochem., 273–293.
10. Nei, M. és Tajima, F. (1981). Restrikciós endonukleázokkal detektálható DNS polimorfizmus. Genetika, 145-163.
11. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., és Wende, W. (2005). A sejt- és molekuláris élettudomány II. Típusú restrikciós endonukleázjai: szerkezete és mechanizmusa. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 685–707.
12. Roberts, R. (2005). Hogyan váltak a restrikciós enzimek a molekuláris biológia munkafőivé. PNAS, 102 (17), 5905–5908.
13. Roberts, RJ és Murray, K. (1976). Restrikciós endonukleázok. Kritikus áttekintés a biokémiában, (november), 123-164.
14. Stoddard, BL (2005). A homing endonukleáz felépítése és működése. A biofizika negyedéves áttekintése, 1–47.
15. Tock, MR és Dryden, DTF (2005). A restrikció és anti-restrikció biológiája. A jelenlegi vélemény a mikrobiológiában, 8, 466–472.
16. Wilson, G. G. és Murray, NE (1991). Korlátozó és módosító rendszerek. Annu. Genet tiszteletes., 25, 585-627.
17. Wu, Z., és Mou, K. (2016). Genomi betekintés a Campylobacter jejuni virulenciába és a populációgenetikába. Infec. Dis. Transz. Med., 2 (3), 109–119.
18. Yuan, R. (1981). A multifunkcionális restrikciós endonukleázok felépítése és mechanizmusa. Annu. Biochem. 50, 285-315.