OXIDÁZ TESZT: INDOKLÁS, ELJÁRÁS ÉS FELHASZNÁLÁSOK - BIOLÓGIA - 2026

Az oxidáz teszt egy olyan diagnosztikai módszer, amely a citokróm-oxidáz c nevű enzimkomplex jelenlétét mutatja. Ez a rendszer indukálja a citokróm oxidálódássá alakulását, mivel elfogja az oxigént, és ez viszont az utolsó elektronakceptor (H ⁺) a légzési láncban.

Az oxidáz kifejezés rövidítése a citokróm-oxidáz enzimre, más néven indofenol-oxidázra utalva. Az ősi időkben azt hitték, hogy a citokróm-oxidáz és az indofenol-oxidáz enzimek két különböző enzim, de manapság ismertek, hogy azonosak.

Pozitív és negatív oxidáz teszt. Forrás: A gép nem olvasható. Alpha.prim ~ commonswiki feltételezve (szerzői jogi igények alapján).

A citokrómok a vasat tartalmazó hemoproteinek, amelyek kiegészítik a citokróm-oxidáz rendszert. A citokrómok fajonként változhatnak.

A citokrómok különféle fajtái vannak (a1, a2, a3 és 0 citokrómok). Egyes baktériumok csak egyet termelhetnek, mások egyszerre akár kettőt vagy háromot is. Ebben az értelemben az a és a3 citokróm jelenléte c citokróm-oxidáz néven ismert. Ez az a citokróm, amelyet az oxidáz teszt kimutat.

A Neisseria és Pseudomonas nemzetségek citokróm-oxidázt tartalmaznak c. Ezek a nemzetségek pozitív oxidázteszttel járnak, segítve megkülönböztetni őket az Acinetobacter és Stenotrophomonas nemzetségektől.

Vannak más olyan nemzetségek is, amelyek oxidáz-pozitívak.

bázis

A citokróm-oxidáz c rendszer jellemzői

A citokróm-oxidáz c rendszer a következőképpen működik: az oxidáz-pozitív mikroorganizmusok oxigént használnak az aerob légzés útján történő energia előállításához. Ez a rendszer az elektronok szállításának köszönhetően a donor anyagoktól, például a NADH ^+, a receptor anyagokhoz, ebben az esetben az oxigénhez.

Ennek eredményeként energia (ATP) és víz vagy hidrogén-peroxid képződik, a citokróm-oxidáz-rendszertől függően, amely a mikroorganizmus rendelkezik.

Ez az oka annak, hogy az oxidáz-pozitív baktériumok többsége kataláz-pozitív is, ami szükséges a feltárt hidrogén-peroxid eltávolításához, mivel ez az anyag mérgező a baktériumokra.

A citokróm-oxidáz c rendszer jelen van néhány aerob baktériumban, néhány fakultatív anaerobban, néhány mikroaerofil baktériumban, és nincs szigorú anaerob. Ez utóbbi érthető, mivel a szigorú anaerobok nem tudnak oxigén jelenlétében élni, ezért hiányzik a citokróm-oxidáz rendszer.

A teszt elve

Ebben a tesztben olyan anyagokat használ, amelyek mesterséges elektronakceptorokként működnek, helyettesítve a természetes anyagokat az elektronszállító láncban.

Főként festékeket, például parafenilén-diamint és indofenolt használnak, amelyek receptor szubsztrátként és mesterséges elektron donorként működnek.

A parafenilén-diamint a citokróm-oxidáz c rendszer oxidálja. A redukált formában a színezék színtelen, oxidált formájában pedig színű.

Így bizonyítják a citokróm-oxidáz c rendszer jelenlétét; mivel a pozitív reakció levendula vagy kék-lila színű lesz, az alkalmazott reagenstől függően.

Ezzel szemben, ha a légzési láncban az utolsó elektronokat elfogadó anyag eltér az oxigéntől, az oxidáz teszt negatív lesz (nincs színtermelés); ez az eset áll fenn az anaerob mikroorganizmusok esetében.

Hasonlóképpen, ha a mikroorganizmus által használt citokróm különbözik a c citokróm-oxidáztól, akkor a negatív tesztet is megkapja.

Folyamat

Különböző reagensek és protokollok léteznek az oxidáz teszthez, mind ugyanahhoz a célhoz.

reagensek

Kovacs-reagens, Gordon és McLeod-reagens, Nadi-reagens, Carpenter, Suhrland és Morrison reagens, valamint az oxidáz-korongok használata.

-Kovacs-oxidáz reagens

1% tetrametil-p-feniléndiamin-dihidrokloridból áll.

A Kovacs-reagenst úgy állítják elő, hogy 1 g fent említett anyagot 50 ml desztillált vízben old fel. Finoman melegítjük, amíg teljesen fel nem oldódik. Helyezzük egy elegendő kapacitású borostyánsárga üvegbe, és töltsük fel desztillált vízzel 100 ml-re. Használat előtt várjon legalább 15 percet. Fénytől védett hűtőszekrényben tárolandó.

Kovacs-oxidáz-reagenssel szerepel, hogy megkülönböztesse az indolteszt feltárására használt Kovacs-reagenstől. Ez a reagens a legérzékenyebb, kevésbé mérgező, de drágább, mint a többi reagens.

Pozitív reakciót mutat ez a reagens, amikor a kolónia színe levendulará változik, amely gyorsan lilavá válik majdnem feketévé. A negatív reakció nyilvánvaló, mivel a kolóniában nincs színváltozás, vagy enyhén rózsaszínűvé válik. A közeg is sötétedhet, de ez nem jelenti a pozitív reakciót.

E reagenssel a reakcióidő kritikus, az 5-15 másodperc közötti színváltozás pozitív reakciónak tekinthető.

-Gordon és McLeod reagens

Dimetil-p-feniléndiamin-dihidrokloridból, más néven N-dimetil-p-fenilén-diaminból vagy p-amino-dimetil-anilin-monohidrokloridból áll. A készítményt a Kovacs-oxidáz-reagenssel kapcsolatban leírtak szerint állítják elő, helyettesítve az érintett anyagot.

Ez a reagens valamivel stabilabb, mint a Kovacs-oxidáz-reagens, bár a p-fenilén-diamint tartalmazó reagensek instabilok.

Ezt a reakciót később kapjuk pozitívnak, ha a kék-lila szín 10-30 percen belül megjelenik.

-Nadi reagens

1% α-naftil etil-alkoholban (95% etanol) és 1% amino-dimetil-anilinnől áll. Az elegyet egyenlő részekben készítjük abszolút etil-alkohol felhasználásával hígítószerként, amíg a mennyiség 100 ml-re elegendő nem lesz.

- Asztalos, Suhrland és Morrison reagens

1% p-amino-dimetil-alanin-oxalátból áll. Készítsük el a Kovacs-oxidáz-reagenssel kapcsolatban leírtak szerint, a megfelelő anyagot megváltoztatva.

Az oldat készen állásával a tesztcsíkokat az alábbiak szerint készítjük: 6-8 cm Whatman No. 1 szűrőpapír csíkokat 1% dimetil-p-feniléndiamin-oxalát reagenssel impregnálunk.

Hagyjuk, hogy fémmel érintkezés nélkül megszáradjanak, szárítószerrel ellátott, csavarral lezárt edényekben tárolják, és hűtőszekrényben tárolják. Ezek a szalagok 6 hónapig stabilak.

Ez a legstabilabb reagens a fentiek közül, és akár 6 hónapig is eltarthat oldatban. Egy másik pluszpont az, hogy nem színezi a tápközeget a kolónia körül, ha közvetlenül a lemezen használják.

A piros szín megjelenését pozitív tesztnek kell tekinteni.

-Oxidáz lemezek

Kereskedelmi lemezek, amelyeket az oxidázteszthez reagenssel impregnáltak. Számos kereskedelmi márkanév van a piacon.

Használata meglehetősen praktikus, mivel nem kell friss reagenseket elkészíteni, ami megkönnyíti a munkát. A kapott eredmények megbízhatóak, amíg a lemezeket megfelelően megőrzik.

jegyzőkönyvek

Közvetlen lemez módszer, közvetett módszer papíron és oxidáz reagenssel impregnált lemezek használata.

-Direct tábla módszer

2 vagy 3 csepp a fent említett reagensek bármelyikét hozzáadjuk erre a célra közvetlenül a kolóniára / kolóniákra, amelyeket egy tenyésztő táptalaj lemeze tartalmaz, amely nem tartalmaz glükózt.

A kolóniák színének megváltozását, nem pedig a tápközeget kell értelmezni. Az érvényes reakcióidő az alkalmazott reagenstől függ.

- Közvetett módszer papíron

Vágj le egy darab szűrőpapírt (Whatman No. 1) 6 cm ² méretűre és tegye egy üres Petri-csészébe.

Adjon hozzá 2 vagy 3 csepp Kovacs-oxidáz-reagenst a papírra, vegye be a vizsgált kolónia egy részét platina fogantyúval vagy fa fogpiszkálóval, és egyenes vonalban terjessze a reagenssel impregnált papírra. Tolmácsoljon 5-10 másodpercen belül.

A Carpenter, Suhrland és Morrison reagenssel elkészített csíkokkal kolóniát terjesztünk a száraz csíkra. Egyetlen csíkot használunk több törzs vizsgálatára. Értelmezd 10 másodpercenként

-Lemezek (m

Finoman megnedvesítse a kereskedelmi lemezeket steril desztillált vízzel, és helyezze rá a vizsgálandó kolóniára. Javasoljuk, hogy a lemezeket 35 ° C-on használja, ha szobahőmérsékleten vagy hűtött lemezeket használnak, a reakció kissé lassabb. Értelmezze a színváltozást 10 és 20 másodperc között.

Vérben vagy csokoládé-agarban található kolóniák használhatók.

-Lemezek (közvetett módszer)

Nedvesítse a lemezt az előzőekben leírtak szerint. Helyezze egy üres Petri-csészébe. Vegyen elegendő mennyiségű kolóniát egy platina fogantyúval vagy fa fogpiszkálóval történő tanulmányozáshoz, és helyezze a lemezen. Értelmezze a színváltozást 10 és 20 másodperc között.

Használat

A Neisseria és az Acinetobacter nemzetség morfológiai szempontból néha nagyon hasonló, mivel annak ellenére, hogy az Acinetobacter nemzetség egy gram-negatív pálca, néha coccoid formájú lehet, és párban elosztható, a Neisseria nemzetet szimulálva.

Ebben az esetben az oxidáz-teszt valóban hasznos. A Neisseria nemzetség pozitív és Acinetobacter negatív.

A Moraxella nemzetség azonban nagyon hasonló a Neisseria nemhez, és mindkettő pozitív reakciót ad; Ezért a szénhidrátos erjedési teszteket mindig el kell végezni a végleges azonosításhoz.

Másrészt az oxidáz-teszt hasznos az Enterobacteriaceae családba tartozó baktériumok (minden oxidáz-negatív) megkülönböztetésére más fermentoroktól, például a Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas nemzetségtől (oxidáz-pozitív).

A Vibrio és a Helicobacter nemzetség szintén oxidáz-pozitív.

QA

Használjon ismert Escherichia coli törzseket negatív kontrollként, és a Pseudomonas aeruginosa törzseket pozitív kontrollként.

korlátozások

-A reagenseket frissen elkészítve kell használni, szobahőmérsékleten az oldat eltarthatósági ideje rövid, mert nagyon instabilok. Hűtve 5 nap és 2 hét között is eltarthat.

-A reagensek színtelenek, ha színük megváltozik, azokat el kell dobni. A sérült lemezek akkor jelennek meg, mert idővel sötétednek.

-A Kovacs-oxidáz-reagenssel pozitív reakciót 15-60 másodperc között késleltetettnek, 60 másodperc után negatívnak kell tekinteni.

-Haemophylus influenzae negatív oxidáz reakciót eredményez, ha dimetil-p-feniléndiaminnal bármilyen reagenst használ, de pozitív, ha a Kovacs-oxidáz reagenst (tetrametil-p-fenilén-diamin) használják.

-A glükóztartalmú médiumok zavarják a tesztet, és téves negatívumokat eredményeznek.

-A Bordetella pertussis törzsek hamis pozitív reakciót adhatnak, ha erősen koncentrált vér agarlemezekből származnak.

-A fém (vas) fogantyúk használata hamis pozitív reakciót eredményez.

ajánlások

- Mivel a reagensek nagyon instabilok és hajlamosak az oxidációra, ajánlott 1-2 ml aliquot mennyiségeket fagyasztani és szükség szerint eltávolítani.

-A reagens autooxidációjának késleltetésének másik módja az, ha a reagensek elkészítésekor 0,1% aszkorbinsavat adunk hozzá.

-Mivel a reagensek instabilok, ajánlott heti minőség-ellenőrzés.

-A reagenseket, amelyek nem felelnek meg a minőség-ellenőrzési tesztnek, nem szabad használni.

Irodalom

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiológiai diagnózis. 5. kiadás Szerkesztő Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D., Weissfeld A. (2009). Bailey és Scott mikrobiológiai diagnózisa. 12 ed. Szerkesztő Panamericana SA Argentina.
3. "Oxidáz teszt." Wikipédia, a szabad enciklopédia. 2018. január 15, 10:32 UTC. 2019. április 3., 14:03
4. Egészségügyi Világszervezet. Laboratóriumi kézikönyv a fejlődő világban közegészségügyi jelentőségű baktériumkórokozókkal szembeni antimikrobiális szerekkel szembeni érzékenység azonosítására és tesztelésére. Elérhető a következő címen: who.int/drugresistance/infosharing
5. Reagens csíkok a baktériumok oxidáz aktivitásának diagnosztizálására. Rev Cubana Med Trop. 2000; 52 (2): 150-151.